Intramuskulære injektioner Langs motorsiden Plader: en minimalt invasiv tilgang til Shuttle Lysspor Direkte ind motoriske neuroner
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
Sygdomme, der påvirker integriteten af rygmarven motoriske neuroner er blandt de mest invaliderende neurologiske tilstande. I de sidste årtier har udviklingen af adskillige dyremodeller for disse neuromuskulære lidelser billede det videnskabelige samfund med forskellige terapeutiske scenarier formål at forsinke eller vende progressionen af disse betingelser. Ved at udnytte den retrograd maskiner af neuroner, er et af disse fremgangsmåder været at målrette skeletmuskulatur med henblik på at shuttle terapeutiske gener ind i tilsvarende rygmarven motoriske neuroner. Selv når lovende, har succes sådan gen-levering tilgang blevet vanskeliggjort af sub-optimale antal transducerede motoriske neuroner det har hidtil vist sig at give efter. Motor endeplader (MEP) er højt specialiserede regioner på skeletmuskulaturen der er i direkte synaptisk kontakt til rygmarven α motoriske neuroner. I denne forbindelse er det vigtigt at bemærke, at indtil videre, at indsatsen retrogradoverførsel gener i motorneuroner blev foretaget uden henvisning til placeringen af MEP-regionen i de målrettede muskler. Her beskriver vi en simpel protokol 1) for at afsløre den nøjagtige placering af MEP'er på overfladen af skeletmuskulatur og 2) at bruge disse oplysninger til at guide intramuskulær levering og efterfølgende optimal retrograd transport af retrograde sporstoffer i motoriske neuroner. Vi håber at udnytte resultaterne fra disse sporing eksperimenter i yderligere undersøgelser i undersøge retrograd transport af terapeutiske gener til rygmarven motoriske neuroner gennem målretning af parlamentsmedlemmer.
Introduction
Tabet af kontrol over frivillige bevægelser, at resultaterne fra neurologiske tilstande såsom motor neuron sygdom og spinal- samt Duchenne muskelsvind er en invaliderende lidelse, der har høj og langvarig indflydelse på hverdagen for de ramte personer. I det seneste årti har forskningsindsatsen til formål at stoppe eller i det mindste forsinke de skadelige virkninger af disse neuromuskulære sygdomme været en prioritet for mange klinikere og forskere verden over. I denne forbindelse har den seneste generation af dyremodeller, der efterligner disse neuromuskulære sygdomme været medvirkende til at opnå grundlæggende indsigt i de fysiologiske mekanismer bag udviklingen og progressionen af disse betingelser 1-13. Behandling af disse neuromuskulære sygdomme kræver direkte adgang til rygmarven og kan opnås ved rygmarv injektioner 14,15. Nylige fremskridt inden for genterapi har også målrettet de tværstribede muskler i øvre ogunderekstremiteterne til shuttle terapeutiske gener til de tilsvarende α motoriske neuroner, der er placeret inden for den ventrale horn af rygmarven 1,9-13. Dette har imidlertid endnu en lovende strategi undladt at forbedre resultatet af disse neurologiske tilstande. Selv om det er rimeligt at konkludere, at disse fattige kunne blive, i det mindste delvis, tilskrives den lave effektivitet af disse beskyttende gener, kan man ikke udelukke den lave effektivitet af disse gen-levering metoder.
Motor endeplader (MEP'er) er specialiserede områder af skelet myofibre der er indrykket af Axon terminaler store perifere motoriske fibre stammer fra α motoriske neuroner. Sammen, de perifere nerve fiber afslutninger og parlamentsmedlemmerne danner den neuromuskulære forbindelse, dvs., det sted, hvor synaptiske impulser udløst af anterograd frigivelsen af neurotransmitteren acetylcholin. Vigtigt er det, at forholdet mellem perifere nervefibre og parlamentsmedlemmerne er bi-direktnelle, selvom forskellige motorer er ansvarlig for transporten af molekyler og organeller mod samt væk fra neuron somata 16-18. I lyset af disse anatomiske overvejelser, MEP'erne synes at være mål for valg til levering og efterfølgende retrograd transport af genetisk materiale til de tilsvarende motoriske neuroner. I denne sammenhæng er det ikke overraskende, at succesen af motorneuroner transduktion i høj grad afhænger af afstanden mellem den intramuskulære injektion af virale vektorer og musklens MEP'er 19-20. Imidlertid overraskende, den nøjagtige placering af MEP zoner på myofibre laboratoriets rotter og mus, de to arter af valg at modellere neuromuskulære sygdomme, ikke var tilgængelige indtil for nylig.
Vi har produceret omfattende kort over MEP-regionen i flere forben muskler i rotter og mus 21-22. For nylig har vi vist detaljerne i organiseringen af MEP rEgion flere muskler i musen bagben 23 og vi er i øjeblikket analyserer funktionerne i parlamentsmedlemmerne på rotte bagben. I vores hænder, intramuskulære injektioner af retrograd sporstoffer rettet til hele MEP zoner i disse muskler gav anledning til mere mærkede motoriske neuroner, der spænder over mere rygmarv segmenter end tidligere rapporteret. Her præsenterer vi den protokol, der er blevet udviklet i de seneste år til at vise beliggenheden af medlemmerne på den ydre overflade samt hele dybden af bagbenet og forben musklerne i både mus og rotter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intramuskulær målretning og efterfølgende retrograd overførsel af terapeutiske transgener til de tilsvarende α motoriske neuroner til eksperimentel behandling af neuromuskulær tilstand er ikke en ny strategi. For eksempel har denne leveringsmetode blevet anvendt til at forsinke neuromuskulær degeneration på forskellige stadier af ALS progression i SOD1 mus og rotter 1,9-12 samt i mus med SMA 13. Mens lovende er effekten af disse scenarier genterapi været begrænset. I denne forbindel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en National Health & Medical Research Centre (NHMRC) projekttilskud til RM
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neurosciences. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neurosciences. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
