Les injections intramusculaires le long des plaques motrices de fin: une approche minimalement invasive à la navette Tracers Directement dans motoneurones
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
Les maladies affectant l'intégrité des neurones moteurs de la moelle épinière sont parmi les troubles neurologiques les plus débilitantes. Au cours des dernières décennies, le développement de plusieurs modèles animaux de ces maladies neuromusculaires a fourni à la communauté scientifique avec différents scénarios thérapeutiques visant à retarder ou inverser la progression de ces conditions. En tirant parti de la machinerie rétrograde de neurones, une de ces approches a été de cibler les muscles squelettiques afin de gènes thérapeutiques de la navette dans les neurones moteurs de la moelle épinière correspondant. Même si une fois prometteur, le succès de l'approche de livraison tels génique a été entravée par le nombre de sous-optimale des neurones moteurs transduites il a montré jusqu'ici de céder. plaques d'extrémité du moteur (MEPs) sont des régions très spécialisées sur les muscles squelettiques qui sont en contact synaptique direct à la moelle épinière α neurones moteurs. À cet égard, il est important de noter que, jusqu'à présent, les efforts de manière rétrogradetransférer des gènes dans les neurones moteurs ont été faites sans référence à l'emplacement de la région MEP dans les muscles ciblés. Ici, nous décrivons un protocole simple 1) pour révéler l'emplacement exact des députés sur la surface des muscles squelettiques et 2) d'utiliser cette information pour guider la prestation intramusculaire et transport rétrograde optimale ultérieure des traceurs rétrogrades dans les neurones moteurs. Nous espérons que d'utiliser les résultats de ces expériences de traçage dans d'autres études dans l'enquête sur le transport rétrograde de gènes thérapeutiques aux neurones moteurs de la moelle épinière à travers le ciblage des députés.
Introduction
La perte de contrôle du mouvement volontaire qui résulte de troubles neurologiques comme la maladie du motoneurone et spinal- ainsi que l'atrophie musculaire de Duchenne est une maladie débilitante qui a un impact élevée et durable sur la vie quotidienne des personnes touchées. Au cours de la dernière décennie, les efforts de recherche visant à arrêter ou au moins retarder les effets délétères de ces maladies neuromusculaires a été une priorité pour de nombreux cliniciens et les scientifiques du monde entier. À cet égard, la dernière génération de modèles animaux qui imitent ces maladies neuromusculaires a joué un rôle dans l'obtention de connaissances fondamentales sur les mécanismes physiologiques qui sous-tendent le développement et la progression de ces conditions de 1 à 13. Le traitement de ces maladies neuromusculaires exige un accès direct à la moelle épinière et peut être obtenu par des injections de la moelle épinière 14,15. Les progrès récents dans la thérapie génique ont également ciblé les muscles striés de la partie supérieure etmembres inférieurs à gènes thérapeutiques de navette vers les motoneurones α correspondants qui sont situés dans la corne ventrale de la moelle épinière 1,9-13. Cependant, cette stratégie une fois prometteuse n'a pas réussi à améliorer le résultat de ces conditions neurologiques. Alors qu'il est juste de conclure que ces piètres résultats pourraient être, au moins en partie, être attribuable à la faible efficacité de ces gènes protecteurs, on ne peut exclure la faible efficacité de ces méthodes de transfert de gènes.
plaques d'extrémité du moteur (MEPs) sont des régions spécialisées des fibres musculaires squelettiques qui sont en retrait par les terminaisons axonales des grandes fibres motrices périphériques provenant α neurones moteurs. Ensemble, les terminaisons de fibres nerveuses périphériques et les députés forment la jonction neuromusculaire, à savoir, le site où l'influx synaptique sont déclenchées par la libération du neurotransmetteur antérograde, l'acétylcholine. Surtout, la relation entre les fibres nerveuses périphériques et les députés est bi-directional, bien que différents moteurs sont responsables pour le transport des molécules et des organites vers ainsi que l'écart du neurone Somata 16-18. À la lumière de ces considérations anatomiques, les députés semblent être des cibles de choix pour la livraison et le transport rétrograde ultérieure de matériel génétique pour les neurones moteurs correspondants. Dans ce contexte, il est peu surprenant que le succès de neurone moteur transduction dépend fortement de la distance entre l'injection intramusculaire de vecteurs viraux et les députés de la musculaires 19-20. Curieusement, cependant, l'emplacement exact des zones de MEP sur les fibres musculaires du rat de laboratoire et de la souris, les deux espèces de choix pour modéliser les maladies neuromusculaires, ne étaient pas disponibles jusqu'à récemment.
Nous avons produit des cartes détaillées de la région MEP pour plusieurs muscles des membres antérieurs chez le rat et la souris 21-22. Plus récemment, nous avons montré les détails de l'organisation de la MEP région pour plusieurs muscles de la patte arrière de la souris 23 et nous sommes en train d'analyser les caractéristiques des députés de la patte arrière de rat. Dans nos mains, des injections intramusculaires de traceurs rétrogrades dirigés vers les zones MEP entières dans ces muscles ont donné lieu à des neurones moteurs plus marqués qui sont Spanning segments de la moelle épinière plus que rapporté précédemment. Ici, nous présentons le protocole qui a été développé au cours des dernières années pour révéler l'emplacement des députés sur la surface externe ainsi que toute la profondeur de la patte arrière et patte avant muscles de la souris et le rat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ciblage intramusculaire et le transfert rétrograde ultérieure de transgènes thérapeutiques pour les motoneurones α correspondant pour le traitement expérimental de l'état neuromusculaire est pas une nouvelle stratégie. Par exemple, ce mode de livraison a été utilisée pour retarder la dégénérescence neuromusculaire à différents stades de la progression de la SLA chez les souris et les rats SOD1 1,9-12 ainsi que chez les souris avec 13 SMA. Bien que prometteur, l'efficacité d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un Centre national de recherche en santé et médecine (NHMRC) subvention de projet à RM
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
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