मोटर एंड प्लेट्स साथ intramuscular इंजेक्शन: सीधे मोटर न्यूरॉन्स में शटल tracers करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
रीढ़ की हड्डी की मोटर न्यूरॉन्स की अखंडता को प्रभावित रोगों सबसे दुर्बल मस्तिष्क संबंधी शर्तों में से हैं। पिछले दशकों में, इन न्यूरोमस्कुलर विकारों के कई पशु मॉडल के विकास में देरी या इन शर्तों की प्रगति के पीछे के उद्देश्य से विभिन्न चिकित्सकीय स्थितियों के साथ वैज्ञानिक समुदाय प्रदान की गई है। न्यूरॉन्स की प्रतिगामी मशीनरी का लाभ लेने से, इन तरीकों में से एक रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स इसी में शटल चिकित्सकीय जीन के क्रम में कंकाल की मांसपेशियों को लक्षित करने के लिए किया गया है। एक बार होनहार हालांकि, इस तरह के जीन डिलीवरी दृष्टिकोण की सफलता यह अब तक की उपज के लिए दिखाया गया है transduced मोटर न्यूरॉन्स के उप इष्टतम संख्या के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। मोटर अंत प्लेट (MEPs) मोटर न्यूरॉन्स α रीढ़ की हड्डी को सीधा अन्तर्ग्रथनी संपर्क में हैं कि कंकाल मांसलता पर अति विशिष्ट क्षेत्रों के हैं। इस संबंध में, यह ध्यान रखें कि महत्वपूर्ण है, अब तक के प्रयासों प्रतिगमनपूर्वक करने के लिएमोटर न्यूरॉन्स में स्थानांतरण जीन लक्षित मांसपेशियों में एमईपी क्षेत्र के स्थान के संदर्भ के बिना किए गए थे। यहाँ, हम एक सरल प्रोटोकॉल 1) कंकाल की मांसपेशियों की सतह पर MEPs की सटीक स्थान प्रकट करने के लिए और 2) मोटर न्यूरॉन्स में इंट्रामस्क्युलर वितरण और प्रतिगामी tracers के बाद इष्टतम प्रतिगामी परिवहन मार्गदर्शन करने के लिए इस जानकारी का उपयोग करने के लिए का वर्णन है। हम MEPs की लक्ष्य-निर्धारण के माध्यम से रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स के लिए चिकित्सकीय जीन की प्रतिगामी परिवहन की जांच में आगे के अध्ययन में इन अनुरेखण प्रयोगों से परिणाम का उपयोग करने की उम्मीद है।
Introduction
ऐसे मोटर न्यूरॉन बीमारी के रूप में मस्तिष्क संबंधी स्थितियों से परिणाम और spinal- कि स्वैच्छिक आंदोलन के रूप में अच्छी तरह से Duchenne पेशी शोष के नियंत्रण के नुकसान से प्रभावित व्यक्तियों के हर दिन के जीवन पर उच्च और लंबे समय तक चलने प्रभाव है कि एक गंभीर स्थिति है। पिछले दशक के दौरान, बंद या कम से कम इन न्यूरोमस्कुलर रोगों के हानिकारक प्रभाव में देरी करने के लिए लक्ष्य अनुसंधान प्रयासों दुनिया भर के कई चिकित्सकों और वैज्ञानिक के लिए एक प्राथमिकता रही है। इस संबंध में इन न्यूरोमस्कुलर रोगों की नकल है कि पशु मॉडलों की हाल की पीढ़ी इन शर्तों 1-13 के विकास और प्रगति अंतर्निहित शारीरिक तंत्र में मौलिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इन neuromuscular रोग के उपचार के लिए रीढ़ की हड्डी तक सीधी पहुंच की आवश्यकता है और रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन 14,15 के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। जीन थेरेपी में हाल के अग्रिमों भी ऊपरी की धारीदार मांसपेशियों को लक्षित किया है औररीढ़ की हड्डी 1,9-13 के उदर सींग के भीतर स्थित हैं कि इसी α मोटर न्यूरॉन्स के लिए शटल चिकित्सकीय जीन के निचले अंगों। बहरहाल, यह एक बार आशाजनक रणनीति इन स्नायविक शर्तों के परिणाम में सुधार करने के लिए विफल रही है। यह इन गरीब परिणामों हो सकता है कि समाप्त करने के लिए उचित है, कम से कम आंशिक रूप से, इन सुरक्षात्मक जीन की कम प्रभावकारिता के कारण हो, इनमें से एक जीन प्रसव के तरीके की कम प्रभावकारिता को अलग नहीं कर सकते हैं।
मोटर अंत प्लेट (MEPs) मोटर न्यूरॉन्स α से होने वाले बड़े परिधीय मोटर तंतुओं के अक्षतंतु टर्मिनलों से इंडेंट रहे हैं कि कंकाल myofibres के विशेष क्षेत्रों के हैं। साथ में, परिधीय तंत्रिका फाइबर अंत और MEPs यानी neuromuscular जंक्शन, अन्तर्ग्रथनी आवेगों न्यूरोट्रांसमीटर की अग्रगामी रिहाई, एसीटाइलकोलीन से शुरू हो रहे हैं, जहां साइट के रूप में। महत्वपूर्ण बात है, परिधीय तंत्रिका तंतुओं और MEPs के बीच के रिश्ते को द्वि-निदेशक हैराष्ट्रीय, विभिन्न मोटर्स के साथ ही दूर न्यूरॉन से की दिशा में अणुओं और organelles के परिवहन के लिए जिम्मेदार हैं, हालांकि 16-18 somata। इन संरचनात्मक विचारों के प्रकाश में, MEPs के लिए इसी मोटर न्यूरॉन्स के लिए वितरण और आनुवंशिक सामग्री के बाद प्रतिगामी परिवहन के लिए विकल्प का लक्ष्य होना दिखाई देते हैं। इस संदर्भ में, यह मोटर न्यूरॉन पारगमन की सफलता बहुत वायरल वैक्टर और मांसपेशियों की MEPs के 19-20 की इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के बीच की दूरी पर निर्भर करता है कि आश्चर्य की बात नहीं है। हैरानी की बात है, हालांकि, प्रयोगशाला चूहा और माउस के myofibres पर एमईपी क्षेत्रों का सही स्थान है, पसंद की दो प्रजातियों न्यूरोमस्कुलर रोगों मॉडल करने के लिए, हाल ही में जब तक उपलब्ध नहीं थे।
हम चूहा और माउस 21-22 में कई forelimb की मांसपेशियों के लिए एमईपी क्षेत्र का व्यापक नक्शे का उत्पादन किया है। हाल ही में, हम एमईपी आर के संगठन के विवरण से पता चला हैमाउस hindlimb 23 के कई मांसपेशियों के लिए egion और हम वर्तमान में चूहे hindlimb पर MEPs की सुविधाओं का विश्लेषण कर रहे हैं। हमारे हाथ में, इन मांसपेशियों में पूरे एमईपी क्षेत्रों के लिए निर्देशित प्रतिगामी tracers का इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के पहले की रिपोर्ट से भी अधिक रीढ़ की हड्डी खंडों फैले हैं कि अधिक से लेबल मोटर न्यूरॉन्स को जन्म दिया है। यहाँ हम बाहरी सतह पर और साथ ही hindlimb की गहराई भर MEPs के स्थान का पता चलता है और माउस और चूहे दोनों में मांसपेशियों forelimb करने के लिए पिछले कुछ वर्षों में विकसित किया गया है कि प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
Intramuscular लक्ष्य-निर्धारण और neuromuscular हालत की प्रयोगात्मक उपचार के लिए इसी α मोटर न्यूरॉन्स के लिए चिकित्सकीय transgenes के बाद प्रतिगामी स्थानांतरण एक नई रणनीति नहीं है। उदाहरण के लिए, इस वितरण पद्धति SOD1 चूहों और चू?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के आरएम करने के लिए एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य व चिकित्सा अनुसंधान केंद्र (NHMRC) परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
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