모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
척수 운동 뉴런의 무결성에 영향을주는 질환은 신경 쇠약 상태 사이. 지난 수십 년 동안, 이들 신경 근육 질환의 여러 동물 모델의 개발을 지연 시키거나 이러한 상태의 진행을 역전 겨냥한 다른 치료 시나리오와 과학계를 제공했다. 뉴런의 역행 기계 활용함으로써, 이러한 접근 중 하나는 척수 운동 뉴런에 대응하는 셔틀 치료 유전자 순서 골격근을 대상으로하고있다. 일단 유망하지만, 이러한 유전자 전달 방법의 성공은 지금까지 수득 보였다 형질 운동 뉴런의 차선 수에 의해 방해되어왔다. 모터 엔드 플레이트 (MEP들)는 운동 뉴런 α 척수 직접 시냅스 접촉 골격 근육에 고도의 전문 영역이다. 이와 관련하여,이 점에 유의하는 것이 중요하다 지금까지 노력하는 역행운동 뉴런에 전사 유전자 표적 근육 MEP 영역의 위치를 참조하지 않고 제조 하였다. 여기에서는 간단한 프로토콜 1) 골격근의 표면상의 최저 소비 효율 정확한 위치를 드러내 2) 운동 뉴런으로 근육 내 전달 및 역행 트레이서 후속 최적 역행 수송을 안내하기 위해이 정보를 사용을 설명한다. 우리는 유럽 의회 의원의 타겟팅을 통해 척수의 운동 신경 세포에 치료 유전자의 역행 전송 조사에 더 많은 연구에서 이러한 추적 실험의 결과를 활용할 수 있도록 노력하겠습니다.
Introduction
이러한 운동 신경 질환과 같은 신경 학적 조건에서 결과 spinal- 자발적인 운동뿐만 아니라 뒤센 근위축증 제어의 손실 영향을받는 개인의 일상 생활에 높고 오래 지속 영향을 쇠약 상태이다. 지난 10 년간, 중지 또는 적어도 이러한 신경 근육 질환의 해로운 영향을 지연하는 것을 목표로 연구 노력은 세계의 많은 의사와 과학자에 대한 우선 순위왔다. 이와 관련하여,이 신경 근육 질환을 모방 동물 모델의 최근의 발전은 이러한 조건 1-13의 발생과 진행을 기초로 생리적 인 메커니즘 근본적인 통찰력을 구하는 수단이되어왔다. 이들 신경 근육 질환의 치료는 척수에 직접 액세스를 필요로하며, 척수 주사 14,15 의해 달성 될 수있다. 유전자 치료의 최근 발전은 또한 상단의 가로 무늬 근육을 타겟으로하고척수 1,9-13의 복부 경적 내에 위치 대응 α 운동 신경 셔틀 치료 유전자 낮은 사지. 그러나, 일단이 유망한 전략은 이들 신경의 조건의 결과를 개선하지 못했다. 그것은 이러한 불량한 결과가 될 수 있다고 결론 공정 동안, 적어도 부분적으로, 이러한 보호 유전자의 낮은 효율에 기인 한 이러한 유전자 전달 방법의 낮은 효능을 배제 할 수 없다.
모터 엔드 플레이트 (유럽 의회 의원)는 운동 신경을 α에서 발생하는 대형 주변 모터 섬유의 축삭 터미널로 들여 골격 myofibres의 전문 영역입니다. 함께, 말초 신경 섬유 종말과 유럽 의회 의원은 즉, 신경 근육 접합부, 시냅스 자극이 신경 전달 물질의 선행 성 릴리스, 아세틸 콜린에 의해 트리거하는 사이트를 형성한다. 중요한 것은, 말초 신경 섬유 및 MEP들 사이의 관계를 임시 저장 양방향이고적인는 다른 모터뿐만 아니라 멀리 신경 세포에서 대한 분자와 세포 기관의 수송을 담당하지만, 16-18 인 somata. 이러한 해부학 적 고려 사항에 비추어, 유럽 의회 의원은 해당 운동 신경에 전달 및 유전 물질의 후속 역행 전송을 위해 선택의 대상이 될 것으로 보인다. 이러한 맥락에서, 운동 신경 전달의 성공은 크게 바이러스 벡터 및 근육의 MEP들 19-20의 근육 내 주사 사이의 거리에 의존한다는 놀라운 일이 아니다. 그러나 놀랍게도, 실험실 쥐 및 마우스에 myofibres MEP 영역의 정확한 위치는, 선택의 두 종의 신경 근육 질환 모델, 최근까지 사용할 수 없었다.
우리는 쥐와 마우스 21-22 여러 앞다리 근육의 MEP 지역의 종합적인지도를 제작했다. 최근에, 우리는 MEP (R)의 조직의 세부 사항을 보여 주었다마우스 뒷다리 (23)의 여러 근육 egion 우리는 현재 쥐의 뒷다리에있는 유럽 의회 의원의 기능을 분석하고 있습니다. 우리의 손에, 이러한 근육의 전체 MEP 영역에 관한 역행 추적자의 근육 내 주사는 이전에보고 된 것보다 더 많은 척수 세그먼트에 걸쳐있다 더 레이블 모터 뉴런에 상승했다. 여기에서 우리는 외부 표면 상에뿐만 아니라 뒷다리의 깊이에 걸쳐 최저 소비 효율을 표시 위치 및 마우스와 래트 모두에서 근육 앞다리은 지난 몇 년 동안 개발 된 프로토콜을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
근육 타겟팅 및 신경 근육 상태의 실험적인 치료에 해당하는 α 운동 신경에 치료 유전자의 후속 역행 전송은 새로운 전략이 아니다. 예를 들어, 이러한 전달 방법은 SOD1의 마우스 및 래트에서 1,9-12 ALS 진행의 다른 단계에서뿐만 아니라 SMA 13 마우스에서 신경 근육 퇴행을 지연시키기 위해 사용되어왔다. 유망한 동안, 이러한 유전자 치료 시나리오의 효능은 제한되었다. 이러한 관?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 RM에 국민 건강 및 의료 연구 센터 (NHMRC) 프로젝트 연구비 지원
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neurosciences. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neurosciences. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
