Intramuskulære injeksjoner Langs Motor endeplatene: en minimal invasiv tilnærming til Shuttle Tracers Direkte inn motoriske nerveceller
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
Sykdommer som påvirker integriteten til ryggmargen motoriske nevroner er blant de mest ødeleggende nevrologiske tilstander. I løpet av de siste tiårene, har utviklingen av flere dyremodeller av disse nevromuskulære sykdommer gitt det vitenskapelige samfunn med ulike terapeutiske scenarier som tar sikte på å forsinke eller reversere utviklingen av disse forholdene. Ved å benytte seg av den retrograde maskineri av nerveceller, har en av disse metodene vært mot skjelettmusklene i orden til skyt terapeutiske gener til tilsvarende ryggmargs motoriske nerveceller. Selv om en gang lovende, har lykkes med en slik genavlevering tilnærming blitt hemmet av sub-optimale antallet transduserte motoriske nevroner det har så langt vist seg å gi. Motor endeplater (MEPS) er høyt spesialiserte områder på skjelettmuskulatur som er i direkte synaptisk kontakt til ryggmargen α motoriske nerveceller. I denne forbindelse er det viktig å merke seg at, så langt, arbeidet med å retrogradoverføring av gener i motoriske neuroner ble gjort uten hensyn til plasseringen av MEP regionen i de målrettede muskler. Her beskriver vi en enkel protokoll 1) for å avsløre den nøyaktige plasseringen av parlamentsmedlemmer på overflaten av skjelettmuskulatur og 2) å bruke denne informasjonen til å veilede intramuskulær levering og påfølgende optimal retrograd transport av retrograd tracere i motoriske nevroner. Vi håper å utnytte resultatene fra disse tracing eksperimenter i videre studier til å undersøke retrograd transport av terapeutiske gener til ryggmargen motoriske nevroner gjennom målretting av parlamentsmedlemmer.
Introduction
Tap av kontroll over viljestyrte bevegelser som skyldes nevrologiske tilstander som motor neuron sykdom og spinal- samt Duchenne muskelatrofi er en ødeleggende tilstand som har høy og langvarig innvirkning på hverdagen til berørte personer. I løpet av det siste tiåret har forskningen som mål å stoppe eller i det minste forsinke de skadelige effektene av disse nevromuskulære sykdommer vært en prioritet for mange klinikere og forskere over hele verden. I denne forbindelse har den siste generasjonen av dyremodeller som etterligner disse nevromuskulære sykdommer vært medvirkende i å få grunnleggende innsikt i de fysiologiske mekanismene bak utvikling og progresjon av disse forholdene 1-13. Behandling av disse nevromuskulær sykdom krever direkte adgang til ryggmargen, og kan oppnås ved ryggmarg injeksjoner 14,15. Nylige fremskritt innen genterapi har også målrettet tverrstripet musklene i øvre ogunderekstremitetene til skyt terapeutiske gener til de tilsvarende α motoriske nerveceller som ligger innenfor den ventral horn av ryggmarg 1,9-13. Imidlertid har dette en gang lovende strategi for klart å forbedre resultatet av disse nevrologiske tilstander. Selv om det er rimelig å konkludere med at disse dårlige resultater kan være, i hvert fall delvis, tilskrives den lave effekten av disse beskyttende gener, kan man ikke utelukke lav effekt av disse genet leveringsmåte.
Motor endeplater (MEPS) er spesialiserte områder av skjelettmuskelfibrene som er innrykket av axon terminaler i store perifere motoriske fibre stammer fra α motoriske nerveceller. Sammen de perifere nerveender og parlamentsmedlemmer danne nevromuskulære krysset, dvs. stedet der synaptiske impulser er utløst av antero frigjøring av signalstoffet, acetylkolin. Viktigere er bi-ret forholdet mellom perifere nervefibre og parlamentsmedlemmerelle, selv om ulike motorer er ansvarlig for transport av molekyler og organeller mot så vel som borte fra nervecellen somata 16-18. I lys av disse anatomiske betraktninger, parlamentsmedlemmer synes å være målene for valg om levering og påfølgende retrograd transport av genetisk materiale til de tilsvarende motoriske nerveceller. I denne sammenheng er det ikke overraskende at suksessen til motoriske nervecellen transduksjon i stor grad avhenger av avstanden mellom intramuskulær injeksjon av virale vektorer og musklenes MEPs 19-20. Overraskende, men den nøyaktige plasseringen av MEP soner på muskelfibrene i laboratoriet rotte og mus, de to arter av valget mellom å modellere neuromuskulære sykdommer, var ikke tilgjengelig før nylig.
Vi har produsert omfattende kart over MEP regionen i flere forbena muskler i rotte og mus 21-22. Mer nylig har vi vist detaljene i organiseringen av MEP region for flere muskler i mus bakben 23 og vi er nå analysere funksjoner av parlamentsmedlemmene på rotte bakben. I våre hender, intramuskulære injeksjoner av retrograd tracere rettet til hele MEP soner i disse musklene ga opphav til flere merkede motoriske nevroner som spenner over mer ryggmargssegmenter enn tidligere rapportert. Her presenterer vi protokollen som har blitt utviklet i løpet av de siste årene for å avsløre plasseringen av parlamentsmedlemmene på den ytre overflaten samt hele dybden av bakben og forbena muskler i både mus og rotter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intramuskulær målretting og påfølgende retrograd overføring av terapeutiske transgener til de tilsvarende α motoriske nerveceller for eksperimentell behandling av nevromuskulær tilstand er ikke en ny strategi. For eksempel har denne leveringsmetoden blitt anvendt for å forsinke neuromuskulær degenerasjon i forskjellige stadier av ALS progresjon i SOD1 mus og rotter 1,9-12 samt i mus med SMA 13. Mens lovende, har effekten av disse genterapi scenarier vært begrenset. I denne forbindelse, fo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en National Health & Medical Research Centre (NHMRC) prosjektstøtte til RM
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neurosciences. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neurosciences. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
