Внутримышечных инъекций по плитам двигателя End: Минимально инвазивная подход к Shuttle TRACERS Непосредственно в моторные нейроны
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
Болезни, влияющие на целостность спинного мозга двигательных нейронов являются одними из самых изнурительных неврологических заболеваний. За последние десятилетия, разработка нескольких моделей животных этих расстройств нервно-мышечных предоставил научное сообщество с различных терапевтических сценариев, направленных на затягивание или обратить вспять прогрессирование этих условиях. Воспользовавшись ретроградной техники нейронов, один из этих подходов в том, чтобы предназначаться скелетные мышцы для того, чтобы челночных терапевтических генов в соответствующие спинного мозга двигательные нейроны. Хотя когда-то перспективным, успех таких генов подхода доставка была затруднена суб-оптимальным количеством преобразованных двигательных нейронов, что до сих пор, показанных на выход. Со стороны двигателя пластины (MEPS) являются узкоспециализированными области на скелетной мускулатуры, которые находятся в непосредственном контакте с синаптической спинного мозга α моторных нейронов. В связи с этим, важно отметить, что до сих пор усилия, чтобы ретроградноГены передачи в моторных нейронов были сделаны без ссылки на положения региона MEP в целевых мышцах. Здесь мы опишем простой протокол 1), чтобы показать точное местоположение Европарламента на поверхности скелетных мышц и 2) использовать эту информацию, чтобы направлять внутримышечной доставки и последующего оптимального ретроградного транспорта ретроградных индикаторов в моторных нейронов. Мы надеемся, что использовать результаты этих экспериментов розыска в дальнейших исследованиях в расследовании ретроградного транспорта терапевтических генов в нейронах спинного мозга двигательных через адресности Европарламента.
Introduction
Потеря контроля добровольного движения, что приводит от неврологических заболеваний, таких как болезни двигательных нейронов и spinal-, а также мышечной атрофии Дюшенна является изнурительных условие, которое имеет высокую и длительную влияние на каждый день жизни пострадавших лиц. За последнее десятилетие, научно-исследовательские усилия, направленные, чтобы остановить или, по крайней мере задержать пагубные последствия этих нервно-мышечными заболеваниями была приоритетом для многих клиницистов и ученых по всему миру. В связи с этим, в последнее поколение животных моделях, которые имитируют эти нервно-мышечных заболеваний играет важную роль в получении фундаментальных понимание физиологических механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования этих условиях 1-13. Лечение этих нервно-мышечных заболеваний требует прямого доступа к спинного мозга и может быть достигнуто путем инъекций спинного мозга 14,15. Последние достижения в области генной терапии также направлены поперечно-полосатой мышцы верхней инижние конечности челночной терапевтических генов к соответствующим α двигательных нейронов, которые расположены в вентральном роге спинного мозга 1,9-13. Тем не менее, в этот раз перспективной стратегией не удалось улучшить результат этих неврологических заболеваний. В то время как это справедливо заключить, что эти бедные результаты могут быть, по крайней мере, частично, быть связано с низкой эффективности этих защитных генов, нельзя исключать низкую эффективность этих методов доставки генов.
Со стороны двигателя пластины (MEPS) специализированные регионы скелетных миофибрилл, которые отступом от аксонов терминалов крупных периферических двигательных волокон, происходящих из α моторные нейроны. Вместе периферийные окончания нервных волокон и депутаты Европарламента образуют нервно-мышечного соединения, то есть место, где синаптические импульсы вызваны антероградной выпуска нейротрансмиттера ацетилхолина,. Важно отметить, что отношения между периферических нервных волокон и MEPs би-Direcных, хотя различные двигатели отвечают за переноса молекул и органелл к, а также от нейрона somata 16-18. В свете этих соображений анатомических, депутаты Европарламента, кажется, быть целями выбора для доставки и последующего ретроградного транспорта генетического материала в соответствующих моторных нейронов. В этом контексте, это не удивительно, что успех двигательного нейрона трансдукции в значительной степени зависит от расстояния между внутримышечной инъекции вирусных векторов и Европарламента мышцы в 19-20. Удивительно, однако, точное расположение инженерных зон на миофибрилл в лабораторной крысы и мыши, два вида выбора модели нервно-мышечных заболеваний, не были доступны до недавнего времени.
Мы подготовили подробные карты региона MEP в течение нескольких мышц передних конечностей у крыс и мышей 21-22. Совсем недавно мы показали, детали организации MEP гEgion в течение нескольких мышц задней конечности мыши 23, и мы в настоящее время анализа особенностей Европарламента на крыс задней конечности. В наших руках, внутримышечные инъекции ретроградных индикаторов, направленных на целых зон инженерных в этих мышц привело к более меченых мотонейронов, которые, охватывающих более сегментов спинного мозга, чем сообщалось ранее. Здесь мы представляем протокол, который был разработан в течение последних нескольких лет, чтобы выявить расположение Европарламента по внешней поверхности, а также по всей глубине задней конечности и передних конечностей мышцы как мыши и крысы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Внутримышечное таргетинг и последующее ретроградная передача терапевтических трансгенов в соответствующих α моторных нейронов для экспериментального лечения нервно-мышечной состоянии не новая стратегия. Например, этот способ доставки был использован для задержки нервно-мышечную ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальной медицинской и медицинского исследовательского центра (NHMRC) проекта гранта РМ
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neurosciences. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neurosciences. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
