Imagerie en direct de la épendymaire Cilia dans les ventricules latéraux du cerveau de souris
Summary
Utilisation de haute résolution contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie, un ex vivo observation du battement des cils épendymaire mobiles situés dans les ventricules du cerveau de souris est démontrée par live-imagerie. La technique permet un enregistrement de l'unique fréquence ciliaire battant et l'angle battant ainsi que leurs propriétés calcium intracellulaire oscillation de stimulation.
Abstract
Cellules épendymaires multiciliées bordent les ventricules dans le cerveau adulte. La fonction anormale ou de la structure des cils épendymaire est associé à divers déficits neurologiques. Le courant ex vivo l'imagerie en direct de la technique de cils épendymaire mobiles permet une étude détaillée de la dynamique ciliaires suit plusieurs étapes. Ces mesures comprennent: l'euthanasie des souris avec du dioxyde de carbone selon les protocoles de l'Université du institutionnels de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) de Tolède; craniectomy suivie de l'élimination du cerveau et sagittale dissection du cerveau avec un vibratome ou lame tranchante pour obtenir sections très minces à travers les ventricules latéraux du cerveau, où les cils épendymaire peuvent être visualisées. L'incubation des tranches du cerveau dans une plaque à fond de verre personnalisé contenant milieu de Eagle modifié (DMEM) / Haut-glucose de Dulbecco à 37 ° C en présence de 95% / 5% O / CO 2 mélange 2 est essentiel de garder le tissu vivant pendantl'expérience. Une vidéo du battement de cils est alors enregistrée en utilisant une haute résolution contraste d'interférence différentiel microscope. La vidéo est ensuite analysé image par image pour calculer la fréquence ciliaire battant. Cela permet la classification distincte des cellules épendymaires en trois catégories ou types en fonction de leur fréquence ciliaire battant et l'angle. En outre, cette technique permet l'utilisation de l'analyse d'imagerie de fluorescence à grande vitesse pour caractériser les propriétés uniques intracellulaires d'oscillation de calcium de cellules épendymaires, ainsi que l'effet des agents pharmacologiques sur les oscillations de calcium et la fréquence ciliaire battant. De plus, cette technique est adaptée pour l'imagerie par immunofluorescence pour des études de structure de protéine ciliaire ciliaire et localisation. Ceci est particulièrement important dans les études de diagnostic et de phénotype maladie. La principale limitation de la technique est attribuée à la diminution de la circulation en direct de cils mobiles comme les tissus du cerveau commence à mourir.
Introduction
Les cils sont des organites à base de microtubules sensoriels qui se prolongent à partir de la surface cellulaire dans l'environnement extracellulaire. Selon leur organisation des microtubules, les cils peuvent être classés en deux types – "9 + 0» ou «9 + 2". Sur le plan fonctionnel, en fonction de leur mobilité, elles peuvent être classées comme mobiles ou non mobiles cils 1. Cils primaires est un terme couramment utilisé pour désigner «9 + 0" cils non mobiles. Celles-ci ont neuf microtubules doublets parallèles (désignés par '9') et une paire centrale de microtubules est absent à l'intérieur de la gaine centrale (notée "0"). Toutefois, certains «9 + 0" cils, comme cils nodale, qui règlent l'embryon latéralité sont mobiles 2. D'autre part, les cils mobiles sont caractérisés, en plus des neuf doublets de microtubules parallèles, par une paire de doublets central supplémentaire des microtubules et associé à des protéines motrices de la dynéine pour faciliter la motilité. En outre, certains "9+2 "Cils tels que les cils olfactifs sont non mobiles 3. Cellules épendymaires bordant les ventricules cérébraux et le canal central de la moelle épinière sont caractérisés par ce que les franges sont mobiles à propulser le liquide céphalo-rachidien (LCR) le long des quatre ventricules du cerveau.
L'objectif global de cette méthode est de faciliter l'étude de la dynamique des cils mobiles et des anomalies structurelles. La santé et le développement du cerveau dépendent fortement sur la circulation efficace des CSF dans les ventricules cérébraux. Par exemple, les flux de CSF normale et l'équilibre des fluides exigent battement normal et cils épendymaire fonctionnelle 5,6, qui à son tour jouer un rôle critique dans la régulation du mouvement directionnel des cellules neuronales et la migration des cellules souches 7. En tant que tel, la fonction des cils épendymaire anormale ou une structure peut conduire à l'écoulement de CSF anormale, qui est associé à une hydrocéphalie, une condition médicale dans laquelle il ya une accumulation anormale de CSF dans les ventricules du bpluie. Cela peut par conséquent entraîner une augmentation de la pression intracrânienne et l'élargissement progressif de la tête, convulsions, vision en tunnel, et la déficience mentale 8.
Les avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'il a permis pour la première fois de signaler trois types de cellules épendymaires distinctes: I, II, et III, en fonction de leur fréquence ciliaire battant unique et angle de battre. Ces cellules épendymaires sont localisées à l'intérieur de certaines régions dans les ventricules du cerveau. En outre, les effets de l'âge et des agents pharmacologiques tels que l'alcool et cilostazol sur la modification des types de cellules épendymaires ou leurs localisations peuvent être démontrés, ce qui était impossible avant cette classification des cellules épendymaires. Le cilostazol est un inhibiteur de la phosphodiestérase-3, une enzyme qui métabolise l'AMPc en AMP et il régule également calcium intracellulaire 9. En utilisant l'analyse de l'imagerie de fluorescence à haute vitesse permet l'imagerie et à la quantification de l'intracellulaire uniquespropriétés d'oscillation de calcium des cellules épendymaires. Par exemple, l'alcool et cilostazol modifiées de manière significative la fréquence ciliaire épendymaire battant ainsi que les oscillations de calcium intracellulaire propriétés qui, à son tour, pourrait conduire à un changement dans le volume de remplacement liquide céphalo-rachidien par cils épendymaire 10. En résumé, cette technique a été la clé pour fournir la première preuve de trois types distincts de cellules épendymaires avec différentes propriétés d'oscillation de calcium.
Dans la section suivante, un aperçu détaillé étape par étape de la procédure est prévue, en accordant une attention particulière à la préparation des tissus et de la manutention.
Protocol
Representative Results
Discussion
On décrit ici est un protocole de préparation de tissu de cerveau de souris à la fois pour l'imagerie en temps réel, et la microscopie de fluorescence qui fournit une observation attentive rapide et sensible des cils épendymaire dans les ventricules du cerveau. Cette technique ne se limite pas au seul ventricule latéral; il pourrait être utilisé pour observer les franges dans une autre ventricules du cerveau. Cette technique d'imagerie fournit un flux en direct qui ressemble le mouvement de la CSF par ba…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
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