בו זמנית<em> Vivo לשעבר</em> בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em> In vivo</emמערכת electroretinogram>
Summary
Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.
Abstract
An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.
Introduction
Electroretinogram (ERG) הוא טכניקה מבוססת היטב כי ניתן להשתמש כדי להקליט את הפעילות החשמלית של הרשתית מופעלת על ידי אור. אות ERG מופקת בעיקר משינויי מתח שנגרמו על ידי זרמי רדיאלי (לאורך הציר של קולטני האור ותאים דו קוטביים) זורמים במרחב תאי ההתנגדות של הרשתית. אות ERG הראשונה נרשמה בשנת 1865 על ידי הולמגרן מפני שטח של עין דג 1. Einthoven וJolly 1,908 2 חילקו את תגובת ERG לתחילתה של אור לשלושה גלים שונים, נקראת a-, B-, וג-גלים, שכיום ידועים שישקפו בעיקר את הפעילות של קולטני האור, על תאים דו קוטביים, ואפיתל הפיגמנט תאים, בהתאמה 3-8. ניתן להקליט ERG מהעיניים של בעלי חיים או בני אדם (in vivo) בהרדמה, מהכנת עין מבודדת 9, על פני רשתית שלמה מבודדת (לשעבר vivo) 3,10-15 או על פני שכבות רשתית ספציפיות עם microelectrodes (מקומיERG) 4,16. מבין אלה, in vivo ERG הוא כיום השיטה הנפוצה ביותר להערכת תפקוד רשתית. זוהי טכניקה לא פולשנית שיכול לשמש למטרות אבחון או למעקב ההתקדמות של מחלות רשתית בבעלי חיים או חולים. עם זאת, בvivo הקלטות ERG לייצר אות מורכבת עם מספר מרכיבים חופפים, לעתים קרובות מזוהמות ברעש extraocular הפיזיולוגי (למשל, נשימה ופעילות לב).
ERG המקומי ניתן להשתמש כדי להקליט את האות על פני שכבות מסוימות של הרשתית אבל זה חודרני ביותר ויש לו את היחס הנמוך ביותר אות לרעש (SNR) בהשוואה לתצורות הקלטת ERG האחרות. ERG המקומי הוא גם תובעני מבחינה טכנית ודורש ציוד יקר (למשל, מיקרוסקופ וmicromanipulators). Transretinal ERG מהרשתית שלמה, מבודדת (לשעבר vivo ERG) מציע פשרה בין in vivo ושיטות ERG מקומיים המאפשרת יציב וHIGהקלטות h SNR מרשתית שלמה של בעלי חיים או בני אדם 17. לאחרונה, שיטה זו שמשה בהצלחה ללמוד לתפקד מוט וקולטי אור חרוט ברשתית של יונקים, קופים ובני אדם 18-20. בנוסף, בשל היעדר אפיתל הפיגמנט ברשתית vivo לשעבר, מרכיב ג-הגל החיובי של אות ERG מוסר ורכיב איטי שלילי בולט PIII מתגלה בvivo לשעבר ההקלטות. רכיב PIII האיטי הוכח מקורן את הפעילות של תאי גליה מולר ב21-23 הרשתית. לפיכך, לשעבר vivo שיטת ERG יכול לשמש גם כדי ללמוד תאי מולר ברשתית ללא פגע. גם מספר מחקרים הראו כי vivo לשעבר הקלטות ERG יכולים לשמש למדידת ריכוז של סוכנים תרופתיים סביב 24 הרשתית ולבדוק את הבטיחות ויעילות של תרופות 25-27.
מסחרי מרובים במערכות vivo זמינים ומשמש במעבדות רבות שלא בהכרח יש לי רקע אלקטרופיזיולוגיה נרחב. לעומת זאת, מכשירי vivo לשעבר לא היו זמינים עד לאחרונה 17 וכתוצאה מכך רק מעט מאוד מעבדות כיום מנצלות טכניקה רבת עוצמה זו. זה יהיה מועיל לבצע הקלטות vivo לשעבר ERG זמינים ליותר מעבדות במטרה לקדם את הידע שלנו על פיזיולוגיה והפתולוגיה ברשתית, ולפתח טיפולים חדשים למחלות מסנוורים. אנו מדגימים כאן מכשיר vivo לשעבר ERG פשוט ובמחיר סביר 17 ולהראות כיצד ניתן להשתמש בו בשילוב עם מספר מערכות vivo ERG הזמינים מסחרי בלהקליט איתות rod- ותיווך קונוס (a- וB-גלים) והפונקציה של תאי מולר (להאט PIII) מרשתית עכבר wild-type בשלמותה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מדגימים כאן את השלבים הקריטיים להשגת הקלטות vivo ERG לשעבר באיכות גבוהה בו זמנית משתי רשתיות עכבר מבודדות באמצעות רכיבים במערכת vivo ERG יחד עם vivo לשעבר מתאם ERG. במחקר זה אנו perfused שני הרשתיות מבעלי החיים עם אותו הפתרון (או איימס ', לוק של או רינגר) ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH EY019312 מענקים וEY021126 (VJK), EY002687 למחלקת העיניים ומדעים חזותיים באוניברסיטת וושינגטון, ועל ידי מחקר למניעת עיוורון.
Materials
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
- Armington, J. C. . The Electroretinogram. , (1974).
- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
- Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
- Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
- Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
- Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
- Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
- Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
- Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
- Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
- Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
- Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
- Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
- Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
- Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
- Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
- Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
- Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
- Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
- Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
- Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
- Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
- Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).
