Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Dit werk beschrijft de synthese van een niet-emitterende, cyclometalated Ir (III) complex, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1), die een snelle, langlevende fosforescerende signaal opwekt wanneer gecoördineerd aan een histidine- bevattend eiwit geïmmobiliseerd op het oppervlak van een magnetisch deeltje. Synthese van IR1, in hoge opbrengsten, voltooid O / N en omvat splitsing van het bovenliggende cyclometalated Ir (III) chloro-gebrugd dimeer in twee equivalenten van de gesolvateerde complex. Om de specificiteit te bevestigen, werden verschillende aminozuren gesondeerd voor de coördinatie activiteit wanneer toegevoegd aan de gesynthetiseerde probe, en slechts histidine ontlokte een signaal reactie. Met behulp van BNT-II, een vertakt peptide nabootsing van de malaria biomarker Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), werd de iridium sonde gevalideerd als een instrument voor HRP-II detectie. Afschrikken effecten werden in het BNT-II / IR1 titratie vastgesteld in vergelijking met L-Histidine / IR1, maar deze werden aan sterische hindering en triPlet staat blussen. Biolayer interferometrie gebruikt voor real-time kinetiek van interactie van IR1 met BNT-II te bepalen. Nadat het systeem is geoptimaliseerd, de detectiegrens van rcHRP-II met de probe bleek 12,8 nM in oplossing. Wanneer dit eiwit geïmmobiliseerd op het oppervlak van een 50 urn magnetische agarose deeltjes, de detectiegrens was 14,5 nM. De robuuste signaalresponsie van deze anorganische probe, alsook de gebruiksflexibiliteit in oplossing of geïmmobiliseerd op een oppervlak, kan leent tegen een verscheidenheid aan toepassingen van diagnostische beeldvorming gebruik.
Colorimetrische en tl-etikettering is een belangrijke methode voor het opsporen en volgen van biochemische moleculen en verwerkt 1,2. De meest voorkomende fluorescente merkers zijn laagmoleculaire organische kleurstoffen 3,4, maar deze moleculen niet altijd ideaal optische eigenschappen. Fluorescente kleurstoffen zijn gevoelig voor fotobleken, vaak kleine Stokes verschuivingen, en kunnen overlappen excitatie- en emissiespectra. Colorimetrische kenmerken wordt vaak bereikt door middel van enzymatische labels, die een versterkt signaal bruikbaar immunoassay kwantificatie 5,6 hebben. Deze enzymen hebben ook hun nadelen, zoals lichtgevoeligheid, reactie- omstandigheden en korte substraat houdbaarheid. Deze eigenschappen hebben de neiging om immunoassays en eiwitmarkerend vereisen onder goed gecontroleerde omstandigheden met behulp kostbare reagentia te doen.
Emissive overgangsmetaalcomplexen zijn onderzocht als alternatieve benadering labeling for biochemische detectie. Vooral cyclometalated Ir (III) werd onderzocht in de context van organische lichtgevende diodes (OLED's) 09/07 zuurstof sensor 10, 11 katalyse en eiwit / cel kleuring 12-14. Hoge fotostabiliteit en quantum efficiency maken deze klasse van probes een goede kandidaat voor biomolecuul detectie 15,16. Eerder werd gevonden dat cyclometalated Ir (III) complexen van de vorm [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, histidine onomkeerbaar binden en wekken een blauwgroene signaalrespons 12,17. Deze complexen zijn niet-emitterende in de solvento toestand, maar wanneer histidine verplaatst het oplosmiddel moleculen en bindt aan het metaalcentrum, zij een intense fosforescerend signaal na langegolf UV straling vrij. Dit signaal treedt alleen op na ligand substitutie, en is het resultaat van een triplet state electron ontspannen naar de grondtoestand door de activering van metaal ligand ladingsoverdracht (3 MLCT) en ligand gecentreerd overschrijving (3 LC) trajecten 8,15. Deze complexen kunnen eventueel worden gebruikt als probes voor de detectie histidine-rijke eiwitten.
Histidine-rijke eiwitten en hun regulering zijn belangrijke bij vele ziekten, waaronder levercirrose, kanker en aandoeningen trombische. 18 Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (pfHRP-II) in het bijzonder is een goed gevalideerde biomarker voor malariaparasiet infectie. Dit eiwit is 67 kDa en bevat 34% histidine, meestal binnen karakteristieke AHHAHHAAD herhalende motieven 19. Deze histidine herhalingen kan binden vrije metaalionen 19 en heem complexen 20 in gastheer bloed. pfHRP-II wordt vaak gedetecteerd in low-resource-instellingen met behulp van immunochromatographic snelle diagnostische tests (RDTs), maar deze tests zijn vaak onnauwkeurig vanwege sample omstandigheden, lage biomarker concentratie, slechte productie normen, en antilichaam degradatie 21.
<p class="Jove_content">-Metaalbevattende fosforescerende sondes zoals cyclometalated Ir (III) complexen bovenbeschreven aantrekkelijke mogelijkheden voor de detectie van pfHRP-II vanwege hun selectieve binding van histidine en hun stabiele en efficiënte emissie-eigenschappen. In dit document wordt het gebruik van [Ir (ppy) 2 (H2O) 2] + (IR1) tot BNT-II, een vertakt peptide nabootsing van pfHRP-II onderzocht 22 detecteren. Kinetiek van deze interactie zijn in real time via biolayer interferometrie technieken. De test werd ingericht om een on-bead ELISA-type format, waarbij nanomolair aantoonbaarheidsgrenzen werden bereikt. Deze test heeft voordelen ten opzichte van traditionele ELISA omdat het kan worden uitgevoerd in minder dan 2 uur met antilichaam-vrije reagentia, in plaats van 4-5 hr en biologische reagentia nodig met typische ELISA.Als microdeeltjes gebaseerde diagnostische hulpmiddelen op de voorgrond van moderne diagnostische technologie, detectie van doelwit biomoleculen rechtstreeks op het oppervlak van het deeltje een groot voordeel. Traditionele moleculaire detectiemethoden zoals ELISA en PCR, zijn voordelig, doordat zij zeer lage detectiegrenzen 25 kan bereiken. Echter, deze testen vereisen uitgebreide reagentia en langdurige protocols. Deze test werd ontworpen om ELISA-type sandwich interacties nabootsen zonder de tijd en reactieve vereisten (figuur 5). Bovendien zijn de kosten van de IR1 probe per monster werd geschat op rond een cent, terwijl de kosten van antilichamen voor een typische ELISA Vertaald 0,20-0,30 per monster.
Omdat de hierboven beschreven werkwijzen steunen op een cyclometalated iridium probe voor detectie van malaria biomarker zou deze probe niet storingsgevoelig modes bij andere detectiemethoden (bijv. Fluorofoor quenchi wordenng en antilichaam / enzym afbraak). Histidine is uniek in zijn metalen bindende eigenschappen. De geschetste werkzaamheden maakt gebruik van dit fenomeen door vervanging van de antilichamen in een typische sandwich ELISA met metaal complexen. Ni (II) NTA vangt rcHRP-II op het oppervlak van het deeltje en IR1 signaleert de aanwezigheid van het eiwit. De meest kritische stap bij het onderzoek wordt waardoor de magnetische deeltjes te mengen met het monster en de probe. In een 96-putjesplaat ELISA, de biomoleculen en reagentia evenwicht bereiken met het tweedimensionale oppervlak van de bodem van de put. Magnetische deeltjes de neiging te regelen uit oplossing door hun dichte ijzeroxide kern, waarbij de beschikbare bindingsplaatsen zou verminderen. Zo moet de deeltjes gemengd worden gedurende de testduur te garanderen maximale binding.
Bij het ontwerpen van een reagens voor diagnostica, moet men rekening houden met de vorm van patiëntmonster en de fysiologische concentratie van de biomarker. Voormalaria, kan de concentratie van pf HRP-II in het bloed van de patiënt variëren van laag naar hoog picomolaire nanomolair. Hoewel deze test is klinisch relevant voor de hogere niveaus van de infectie, de detectielimiet moet worden verbeterd om asymptomatische patiënten op te sporen met een lage picomolaire circulerende pf HRP-II. In de hierboven beschreven werkwijzen, het "inschakel" signaal gegenereerd door IR1 plaatsvindt in de aanwezigheid van histidine. Terwijl de malaria biomarker is rijk aan histidine, andere serumeiwitten, zoals humaan serum albumine en histidine rijk glycoproteïne, zou een signaal met de probe response opwekken. Dit zou op zijn beurt leiden tot een vals positieve diagnoses. Dit maakt het vangen van het eiwit op het oppervlak van het deeltje een positieve stap in het eiwit van belang kan snel worden geëxtraheerd uit een patiëntenmonster. Bovendien, het ontwerpen van een bifunctionele sonde, dat paren een histidine rijke peptide om een robuuste moleculaire herkenning element (dwz. Aptameer), Zou een andere laag van specificiteit aan de bepaling. Het peptide zal worden geladen met iridium voordat koppeling aan de aptameer. In een dergelijk ontwerp, kan de stabiele IR1 sonde nog steeds gebruikt worden, terwijl het bereiken doel specificiteit van de aptameer. Zodoende zou de toepassing van de sonde natieve HRP-II te detecteren in een complexe matrix (bijv. Plasma of volbloed) en niet-specifieke binding te verminderen. Om het signaal van snelle diagnostische tests te verbeteren zouden de assay in een elektrochemiluminescent (ECL) systeem, waarbij pf HRP-II kan worden gedetecteerd op de RDTs een elektrochemische uitlezing 26 worden opgenomen. Deze volgende generatie iridium probe zou sterk verbeteren onze on-bead ELISA assay voor de detectie van ziekte biomarkers.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |