Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
ويعرض هذا العمل على توليف الخالية من الانبعاثات، cyclometalated عير (III) المجمع، عير (PPY) 2 (H 2 O) 2 + (IR1)، الذي يتسبب سريعة، المعمرة إشارة الفسفورية عندما منسقة لhistidine- تحتوي على البروتين ثبتوا على سطح الجسيمات المغناطيسية. توليف IR1، في عوائد عالية، هو O كاملة / N وينطوي على تقسيم الوالد cyclometalated عير (III) ديمر-سد كلورو إلى قسمين حكمه من مجمع الإذابة بالإكترونات. لتأكيد خصوصية، تم بحث العديد من الأحماض الأمينية لنشاط التنسيق عند إضافتها إلى التحقيق توليفها، والحامض الاميني الوحيد إلى استجابة الإشارة. استخدام BNT-II، وهو تقليد الببتيد متفرعة من العلامات البيولوجية للملاريا البروتين الحامض الأميني ريتش II (pfHRP-II)، والتحقق من صحة التحقيق الايريديوم كأداة للكشف عن HRP-II. وقد لوحظت آثار التبريد في المعايرة BNT-II / IR1 بالمقارنة مع الحامض الأميني L-/ IR1، ولكن نسبت هذه إلى عائق الفراغية وثلاثيPLET التبريد الدولة. وقد استخدم Biolayer التداخل لتحديد حركية في الوقت الحقيقي من تفاعل IR1 مع BNT-II. مرة واحدة وكان محسن النظام، تم العثور على الحد من الكشف عن rcHRP-II باستخدام مسبار لتكون 12.8 نانومتر في الحل. عندما يجمد هذا البروتين على سطح 50 ميكرون المغناطيسي الجسيمات الاغاروز، كان الحد من الكشف 14.5 نانومتر. استجابة قوية إشارة من هذا التحقيق غير العضوية، فضلا عن المرونة استخدامه في حل أو يجمد على السطح، ويمكن ان تقدم نفسها تجاه مجموعة متنوعة من التطبيقات، من استخدام التشخيص التصوير.
وضع العلامات اللونية والفلورسنت هو وسيلة هامة للكشف وتتبع من الجزيئات الكيميائية الحيوية والعمليات 1،2. علامات الفلورسنت الأكثر شيوعا هي منخفضة الوزن الجزيئي الأصباغ العضوية 3،4، ولكن هذه الجزيئات لا تملك دائما الخصائص البصرية مثالية. الأصباغ الفلورية عرضة للphotobleaching من، غالبا ما يكون التحولات ستوكس صغيرة، وربما متداخلة الإثارة والأطياف الانبعاثات. وكثيرا ما يتم وضع العلامات اللونية من خلال استخدام بطاقات الأنزيمية، والتي لها إشارة تضخيم مفيدة في المناعه الكمي 5،6. تتمتع هذه الانزيمات أيضا سلبياتها، بما في ذلك حساسية للضوء، وظروف التفاعل، والركيزة قصيرة الصلاحية. هذه الخصائص تميل إلى تتطلب المناعية وطرق وضع العلامات البروتين الذي يتعين القيام به في ظل الظروف التي تسيطر عليها بشكل جيد باستخدام الكواشف مكلفة.
تم استكشافها المجمعات الانتقال المعادن انبعاثاتها كنهج بديل العلامات FOص كشف الكيمياء الحيوية. على وجه الخصوص، cyclometalated عير (III) وقد درس في سياق ضوء الثنائيات العضوية (شاشات OLED) 7-9 الأوكسجين الاستشعار 10، 11 الحفز، وبروتين / خلية تلطيخ 12-14. صمود عالية وكفاءة الكم جعل هذه الفئة من تحقيقات مرشحا جيدا للكشف عن جزيء حيوي 15،16. وجد سابقا أن cyclometalated عير (III) المجمعات، النموذج [عير (C ^ N) 2 (يذاب) 2] +، ربط بشكل لا رجعة فيه الحامض الاميني واستثارة رد فعل إشارة الأخضر والأزرق 12،17. هذه المجمعات هي غير انبعاثاتها في ولاية solvento، ولكن عندما نزوح الحامض الاميني جزيئات المذيب وبربط مركز معدنية، يطلقون إشارة الفسفورية مكثفة بعد التشعيع موجة طويلة للأشعة فوق البنفسجية. هذه الإشارة يحدث إلا بعد استبدال يجند، ونتيجة لالإلكترون دولة الثلاثي الاسترخاء للدولة أرض الواقع من خلال تفعيل المعادن نقل المسؤول يجند (3 ML CT) ويجند تركزت نقل (3 LC) مسارات 8،15. يمكن أن يحتمل هذه المجمعات استخدامها تحقيقات الكشف عن البروتينات الحامض الاميني الغنية.
البروتينات الحامض الاميني الغنية ومستويات تنظيمها مهمة في كثير من الأمراض، بما في ذلك تليف الكبد، والسرطان، واضطرابات thrombic 18 المتصورة المنجلية الحامض الأميني غني البروتين II (pfHRP-II) على وجه الخصوص هو التحقق من صحة العلامات البيولوجية جيدا للعدوى طفيل الملاريا. هذا البروتين هو 67 كيلو دالتون ويحتوي على 34٪ الحامض الاميني، معظمها داخل مميزة AHHAHHAAD تكرار الزخارف 19. ويمكن لهذه يكرر الحامض الاميني ربط أيونات معدنية مجانا 19 و 20 الهيم مجمعات في الدم المضيف. تم الكشف عن pfHRP-II عادة في البيئات المنخفضة الموارد باستخدام الاختبارات التشخيصية السريعة المناعي (أفرقة المديرين الإقليميين)، ولكن هذه الاختبارات غالبا ما تكون غير دقيقة بسبب ظروف العينة، وانخفاض تركيز العلامات البيولوجية، معايير التصنيع الفقيرة، وتدهور الأجسام المضادة 21.
<p class="jove_content"> تحقيقات الفسفورية القائم على المعادن مثل عير cyclometalated (III) المجمعات المذكورة أعلاه هي خيارات جذابة للكشف عن pfHRP-II بسبب من انتقائية ملزمة من الحامض الاميني ومستقر وانبعاث كفاءة ممتلكاتهم. في هذه الورقة، واستخدام [عير (PPY) 2 (H 2 O) 2] + (IR1) للكشف عن BNT-II، وهو تقليد الببتيد متفرعة من pfHRP-II هو استكشاف 22. تم رصد حركية هذا التفاعل في الوقت الحقيقي باستخدام تقنيات biolayer التداخل. وقد تم تكييف فحص أيضا إلى تنسيق ELISA نوع على حبة، حيث تحققت حدود nanomolar من الكشف. هذا الاختبار يحمل من المزايا أكثر من ELISAs التقليدية لأنها لا يمكن أن يؤديها في اقل من 2 ساعة مع الكواشف خالية من الأجسام المضادة، بدلا من ساعة 4-5 والكواشف الحيوية المطلوبة مع ELISAs نموذجية.كأدوات القائم على microparticle التشخيص تأتي في طليعة التكنولوجيا التشخيصية الحديثة، والكشف عن الجزيئات الحيوية الهدف مباشرة على سطح الجسيمات هو ميزة كبيرة. طرق الكشف الجزيئي التقليدية، مثل ELISA وPCR، هي مفيدة، لأنها يمكن أن تحقق حدود منخفضة جدا من الكشف عن 25. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات تتطلب الكواشف واسعة والبروتوكولات طويلة. وقد صمم هذا الاختبار لتقليد ELISA من نوع التفاعلات شطيرة دون الوقت ومتطلبات كاشف (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك، تم تقدير تكلفة التحقيق IR1 لكل عينة لتكون حول فلسا واحدا، في حين أن تكلفة الأجسام المضادة لELISA نموذجي هو 0،20-0،30 دولار للعينة.
منذ الأساليب المذكورة أعلاه تعتمد على التحقيق إيريديوم cyclometalated للكشف عن العلامات البيولوجية الملاريا، فإن هذا التحقيق لا تكون عرضة للفشل وسائط مشتركة لطرق الكشف الأخرى (أي. quenchi fluorophoreنانوغرام وتدهور الأجسام المضادة / انزيم). الحامض الاميني هي فريدة من نوعها في المعادن ملزمة خصائصه. العمل الموضح يستفيد من هذه الظاهرة عن طريق استبدال الأجسام المضادة في شطيرة ELISA نموذجي مع المجمعات المعادن التي تحتوي على. ني (II) NTA يلتقط rcHRP-II على سطح الجسيم وIR1 يشير إلى وجود البروتين. الخطوة الأكثر أهمية في مقايسة هو السماح للجزيئات مغناطيسية لخلط مع العينة والتحقيق. في 96-جيدا لوحة ELISA، والجزيئات الحيوية والكواشف إلى حالة توازن مع سطح ثنائي الأبعاد من قاع البئر. الجسيمات المغناطيسية لديهم ميل إلى تسوية من حل بهم بسبب كثافة النواة أكسيد الحديد، والتي من شأنها أن تقلل من مواقع الربط المتاحة. وبالتالي، يجب أن تكون مختلطة الجسيمات خلال فترة الاختبار لضمان الربط القصوى.
عند تصميم كاشف لتشخيص المرض، لا بد من أن نأخذ في الاعتبار شكل عينة المرضى وكذلك التركيز الفسيولوجي من العلامات البيولوجية. إلىالملاريا، وتركيز الجبهة الوطنية HRP-II في دم المريض يمكن أن تختلف من بيكو مولي منخفضة لnanomolar عالية. في حين أن هذا الاختبار هو ذات الصلة سريريا لتحقيق مستويات أعلى من العدوى، والحد من الكشف يحتاج إلى تحسين من أجل الكشف عن المرضى الذين يعانون أعراض مع انخفاض بيكو مولي المتداولة الجبهة الوطنية HRP-II. في الأساليب المذكورة أعلاه، فإن "التبديل على" إشارة الناتجة عن IR1 يحدث في وجود الحامض الاميني. في حين أن العلامات البيولوجية ملاريا غنية في الحامض الاميني، بروتينات مصل أخرى، مثل ألبومين المصل البشري والحامض الاميني بروتين سكري غنية، من شأنه أن يثير استجابة إشارة مع التحقيق. سيكون هذا بدوره يؤدي إلى تشخيص إيجابية كاذبة. وهذا يجعل من القبض على البروتين على سطح الجسيمات خطوة مفيدة في هذا البروتين من الفائدة يمكن استخراجها بسرعة من عينة المرضى. بالإضافة إلى ذلك، تصميم المسبار bifunctional، أن الأزواج على الحامض الاميني الببتيد الغنية إلى عنصر الاعتراف الجزيئي القوي (أي. aptamer)، يمكن إضافة طبقة أخرى من خصوصية للفحص. ان الببتيد تكون محملة الايريديوم قبل اقتران إلى aptamer. في مثل هذا التصميم، ويمكن للIR1 التحقيق مستقرة لا تزال تستخدم في حين تحقيق خصوصية الهدف مع aptamer. هذا من شأنه أن يسمح للتطبيق لجنة التحقيق للكشف عن الأصلي HRP-II في مصفوفة معقدة (أي البلازما أو الدم الكامل) والحد من الآثار غير الملزمة محددة. من أجل زيادة تعزيز إشارة من الاختبارات التشخيصية السريعة، ويمكن إدراج الفحص في نظام electrochemiluminescent (ECL)، حيث يمكن الكشف عن الجبهة الوطنية HRP-II على أفرقة المديرين الإقليميين كما قراءات الكهروكيميائية 26. وهذا من شأنه المقبل التحقيق الجيل الايريديوم يعزز إلى حد كبير لدينا ELISA مقايسة على حبة للكشف عن المؤشرات الحيوية المرض.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |