Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Эта работа иллюстрирует синтез без эмиссионного, cyclometalated Ir (III), комплекс, Ir (PPY) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), который вызывает быстрое, долгоживущий сигнал фосфоресцирующие, когда согласованы с histidine- белок, содержащий иммобилизованные на поверхности магнитной частицы. Синтез IR1, с высокими выходами, полна O / N и включает расщепление материнской cyclometalated Ir (III), хлор мостиком димеров в двух эквивалентов сольватированной комплекса. Чтобы подтвердить специфичность, несколько аминокислот были исследованы для координации активности при добавлении к синтезированной пробы, и только гистидин вызвало отклик сигнала. Использование BNT-II, разветвленную пептид подражанием малярийного биомаркеров гистидин богатые белком II (pfHRP-II), иридий зонд был утвержден в качестве инструмента для обнаружения HRP-II. Тушение эффекты были отмечены в титрования БНТ-II / Ir1 по сравнению с L-гистидин / Ir1, но они были отнесены к стерических препятствий и триплет государственной тушение. Бислоя интерферометрии был использован для определения в реальном времени кинетику взаимодействия с IR1 BNT-II. После того как система была оптимизирована, предел обнаружения rcHRP-II с использованием зонда было установлено, что 12,8 нМ в растворе. При этом белок был иммобилизован на поверхности магнитного агарозном частицы 50 мкм, предел обнаружения составлял 14,5 нМ. Надежный ответный сигнал этого датчика неорганической, а также его гибкость использования в растворе или иммобилизовать на поверхности, может поддается к различным приложениям, от диагностики к визуализации.
Колориметрический и флуоресцентные маркировки является важным методом для обнаружения и отслеживания биохимических молекул и процессов 1,2. Наиболее распространенными флуоресцентные маркеры низкомолекулярные органические красители 3,4, но эти молекулы не всегда идеальные оптические свойства. Флуоресцентные красители склонны к фотообесцвечиванию, часто имеют небольшие сдвиги Стокса, и может иметь перекрытие возбуждения и излучения. Колориметрический маркировки часто достигается путем использования ферментативных меток, которые имеют усиленный сигнал в полезную иммуноанализа количественного 5,6. Эти ферменты также имеют свои недостатки, в том числе светочувствительность, условий реакции и короткие подложки срока годности. Эти свойства, как правило, требует иммунологических и методы маркировки белков должно быть сделано в соответствии с хорошо контролируемых условиях с использованием дорогостоящих реагентов.
Эмиссионные переходных металлов комплексы были исследованы в качестве альтернативного подхода маркировки FOг биохимический обнаружения. В частности, cyclometalated Ir (III), был изучен в контексте органических светоизлучающих диодов (OLED) 7-9 кислорода зондирования 10, катализа 11, и белок / клетка окрашивания 12-14. Высокая светостойкость и квантовая эффективность делают этот класс зондов хорошим кандидатом для обнаружения биомолекул 15,16. Было установлено, что ранее cyclometalated Ir (III) комплексов, в виде [Ir (С ^ Н) 2 (Solv) 2] +, необратимо связываются гистидин и вызывают сине-зеленые отклик сигнала 12,17. Эти комплексы не являются эмиссионные в состоянии solvento, но когда гистидин вытесняет молекулы растворителя и связывается с металлическим центром, они выпускают интенсивное фосфоресцирующие сигнал после длинных волн УФ-облучения. Этот сигнал происходит только после замещения лигандов, и является результатом триплетным электрона отдыха в состоянии через активацию металла лиганда переноса заряда (3 млКТ) и лиганда центру перевод (3 LC) путей 8,15. Эти комплексы могут быть потенциально использованы в качестве зондов для обнаружения для гистидина богатой белками.
Богатую гистидином белки и их уровни регуляции важны во многих заболеваний, в том числе цирроз печени, рака и заболеваний тромбомикроангиопатия. 18 Plasmodium тропической гистидин богатые белком II (pfHRP-II), в частности, представляет собой хорошо подтверждена биомаркера для малярийного паразита инфекции. Этот белок 67 кДа и содержит 34% гистидин, в основном в пределах, характерных AHHAHHAAD повторять мотивы 19. Эти повторы гистидиновых может связывать ионы металлов бесплатно 19 и гема комплексы 20 в принимающей крови. pfHRP-II обычно обнаруживается в условиях ограниченных ресурсов с помощью Иммунохроматографические диагностических экспресс-тестов (БДТ), но эти тесты часто неточны из-за показательных условиях, низкой концентрации биомаркеров, бедных производственных стандартов, и деградации 21 антител.
<p class="Jove_content"> на основе металлов фосфоресцирующие зонды, такие как cyclometalated Ir (III), комплексы, описанные выше, являются привлекательными вариантами для обнаружения pfHRP-II из-за их избирательное связывание гистидина и их стабильных и эффективным выбросов свойств. В этой статье, использование [Ir (PPY) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) для обнаружения BNT-II, разветвленную пептид подражанием pfHRP-II исследуется 22. Кинетика этого взаимодействия были отслеживать в режиме реального времени с использованием методов интерферометрии бислоя. Анализ также адаптированы к по-шарик формате ELISA-типа, где были достигнуты наномолярные пределы обнаружения. Этот анализ имеет преимущества по сравнению с традиционными ИФА, поскольку она может быть выполнена в соответствии с 2 ч антител свободной реагентов, вместо 4-5 ч и биологических реагентов, необходимых с типичными ИФА.Как микрочастиц на основе диагностических инструментов на первый план выходят современной диагностической технологии, обнаружение целевых биомолекул непосредственно на поверхности частицы основным преимуществом. Традиционные методы молекулярной обнаружения, такие как ELISA и ПЦР, являются предпочтительными, так как они могут достичь очень низкие пределы обнаружения 25. Тем не менее, эти анализы требуют обширных реагенты и длительные протоколы. Этот анализ был разработан, чтобы имитировать ИФА типа сэндвич взаимодействия без времени и требованиям реагентов (рисунок 5). Кроме того, стоимость зонда IR1 на образец, по оценкам, около пенни, а стоимость антител для типичного ELISA составляет $ 0,20-0,30 за образец.
Поскольку методы, описанные выше, рассчитывать на cyclometalated иридия зонда для выявления малярийного биомаркеров, этот зонд не будет подвержен отказов, общих для других методов обнаружения (т.е. флуорофора. Quenchiнг и деградация антитела / фермента). Гистидин является уникальным в его связывания свойств металла. Рассказал о работе использует этот феномен путем замены антитела в типичном ELISA бутерброд с металлическими содержащий комплексов. Ni (II) НТА захватывает rcHRP-II на поверхности частицы и Ir1 сигнализирует о присутствии белка. Наиболее важным шагом в анализе является позволяя магнитные частицы смешать с образцом и зондом. В 96-луночный планшет ELISA, биомолекулы и реагенты достижения равновесия с двумерной поверхностью дна скважины. Магнитные частицы имеют тенденцию выпадает из раствора из-за их плотного ядра оксида железа, который бы снизить доступные сайты связывания. Таким образом, частицы должны быть смешаны во время анализа для обеспечения максимального связывания.
При проектировании реагент для диагностики заболеваний, следует иметь в виду форму образца пациента, а также физиологическую концентрацию биомаркеров. Длямалярия, концентрация ОФ HRP-II в крови пациента может варьироваться от низкой до высокой пикомолярных нМ. В то время как этот анализ является клинически значимым для более высоких уровней инфекции, предел обнаружения должна быть улучшена для того, чтобы обнаружить бессимптомных пациентов с низким пикомолярных оборотных PF HRP-II. В способах, описанных выше, "включение" сигнал, генерируемый Ir1 происходит в присутствии гистидина. В то время как малярийный биомаркера богата гистидина, другие белки сыворотки, такие как альбумин сыворотки человека и гистидина богатой гликопротеина, будет вызывать ответ сигнала с датчика. Это, в свою очередь привести к ложным положительным диагнозом. Это делает захват белка на поверхности частицы полезным шагом в том, что интерес белок может быть быстро извлечены из образца пациента. Кроме того, проектирование бифункциональную зонд, что пары гистидина богатый пептид надежной элемента молекулярного распознавания (т.е.. Аптамер), Можно добавить еще один слой специфичностью анализа. Пептид будет загружен иридий перед соединением с аптамеров. При такой конструкции, устойчивым Ir1 зонд все еще может быть использован при достижении целевой специфичностью с аптамеров. Это позволит применением зонда для выявления родной HRP-II в комплексной матрицы (т.е.. Плазмы или цельной крови) и снизить неспецифическое связывание эффектов. Для того чтобы дополнительно улучшить сигнал экспресс-тестов, анализ может быть включен в электрохемилюминесцентных (ECL) системы, где PF HRP-II могут быть обнаружены на RDTs как электрохимической считывания 26. Это следующее поколение иридий зонд будет значительно улучшить нашу на-шарик ELISA анализа для обнаружения биомаркеров заболеваний.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |