This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.
يصف هذا البروتوكول كيف مؤقتا وبعد لإسكات نشاط الخلايا العصبية في مناطق الدماغ منفصلة في حين تشارك الحيوانات في مهام التعلم والذاكرة. يجمع بين النهج الدوائي (مصمم-مستقبلات حصريا المنشط تلو مصمم المخدرات) مع النموذج السلوكي (شروط مسبقة الحسي) التي تم تصميمها للتمييز بين أشكال مختلفة من التعلم. على وجه التحديد، ويستخدم تسليم الفيروسية التي تتوسط للتعبير عن مستقبلات المعدلة وراثيا المثبطة G-البروتين يقترن (مصمم مستقبلات) إلى منطقة الدماغ منفصلة في القوارض. بعد ثلاثة أسابيع، عندما تكون مستويات التعبير مصمم مستقبلات مرتفعة، ويدير وكيل الدوائي (مصمم المخدرات) بشكل منتظم 30 دقيقة قبل جلسة سلوكية محددة. المخدرات قد تقارب لمستقبلات مصمم وبالتالي يؤدي إلى تثبيط الخلايا العصبية التي تعبر عن مستقبلات مصمم، بل هي على خلاف ذلك خاملة بيولوجيا. منطقة الدماغ لا يزال إسكات لمدة 2-5 ساعة (depenقرع على الجرعة وطريقة التعاطي). عند الانتهاء من النموذج السلوكي، ويتم تقييم أنسجة المخ لوضع الصحيح ومستقبلات التعبير. هذا النهج هو مفيدة بشكل خاص لتحديد مساهمة من مناطق الدماغ الفردية لعناصر محددة من السلوك، ويمكن استخدامها عبر أي عدد من النماذج السلوكية.
تحديا مثيرا في مجال علم الأعصاب السلوكي هو تحديد ركائز العصبية من السلوكيات المعقدة. وقد تم استخدام عدد من التقنيات مثل الآفات دائمة، تعطيل الدماغ مؤقت عن طريق زرع حقنة عادية وoptogenetics للتعرف على مساهمات من مناطق الدماغ منفصلة لفرعية من السلوكيات المعقدة. في حين أن هذه النهج إبلاغ فهمنا لخصوصية الإقليمية خلال التعلم، كل تقنية ليست دون قيود. على وجه التحديد، وعادة ما تجرى الآفات دائمة قبل الاختبار السلوكي، وبالتالي آثارها موجودة طوال مدة النموذج. دراسات كيفية تركيب الكانيولا التي تنطوي على عرض لinactivator العصبي على المدى القصير (على سبيل المثال، سم الأسماك الرباعية الأسنان) يمكن أن تنتج أضرار كبيرة في أنسجة المخ ويمكن أن تحدث التوتر في المواضيع فقط قبل الاختبار السلوكي. وعلاوة على ذلك، من خلال تعطيل إقناء؛ إدخال القنية يقتصر على المنطقة من الأنسجة التي تحيطغيض من حقنة عادية. وأخيرا، في حين optogenetics يقدم مجموعة من المرونة من أجل السيطرة الزمنية للنشاط في مناطق محددة في الدماغ، فمن باهظة التكلفة وتطلبا من الناحية الفنية.
هذه القيود يمكن التغلب عليها باستخدام نهج pharmacogenetic (مصمم-مستقبلات المنشط حصريا على حدة مصمم المخدرات، DREADDs) 1،2. الأهم من ذلك، في حين أن مفهوم علم الوراثة الدوائي هو متطورة، وتنفيذ أسلوب واضح ومباشر. على غرار الأساليب الجراحية التجسيمي التقليدية التي تنطوي على ضخ السم (على سبيل المثال، NMDA، حمض ibotenic) في مناطق الدماغ منفصلة، وهذا الأسلوب ينطوي على غرس فيروس الغدة المرتبطة (AAV) الذي يحتوي على جزء DNA لمستقبلات تعديل المثبطة G-البروتين يقترن (hM4Di، ومستقبلات مصمم) في المنطقة من اهتمام من القوارض المختبرية القياسية (انظر الشكل 1). يحتوي على ناقلات فيروسية أيضا مراسل فلوري (mcitrine). مرة واحدة مسجلة فيإلى الخلايا، ومستقبلات مصمم (والبروتين مراسل) يتم التعبير عن الحد الأقصى ~ 3 أسابيع بعد الحقن ويمكن تفعيلها بشكل انتقائي لمدة 2-5 ساعة من قبل الإدارة الشاملة للمصمم المخدرات غير ذلك خاملة بيولوجيا، كلوزابين-N-أكسيد (CNO) 1 (3). لأن وهبت المجرب مع دقيقة، بعد جهاز التحكم عن بعد الزمنية على النشاط العصبي في مناطق محددة في الدماغ، علم الوراثة الدوائي يجمع بشكل جيد مع النماذج السلوكية التي تجرى على مراحل متعددة. في هذا المثال، مساهمة من القشرة خلف الطحال (RSC) إلى التحفيز التحفيز تتم مقارنة التعليمية لدورها في التعلم بافلوف، ولكن هذا الجمع بين النهج مناسب تماما إلى أي عدد من الأسئلة التي تسعى إلى تحديد كيفية معينة تساهم مناطق الدماغ ل سلوك معقد.
بالإضافة إلى ذلك، في حين لم توصف في هذا البروتوكول، والنهج الفيروسية والمعدلة وراثيا يمكن استخدامها لتحقيق الخلية نوع معين DREADD التعبير 2. بما انيالصورة الكامنة في النماذج السلوكية التي تنطوي على أنواع الدوائية و / أو غيرها من التلاعب التجريبية، دراسة متأنية من التصميم التجريبي والتحليل الكمي لاحق مطلوب عند إستخدام أسلوب DREADD. ويشار إلى المجربون جديد إلى نهج DREADD إلى مراجعة شاملة لتكنولوجيا DREADD الحالية 2.
كل يوم، الكائنات تعلم حول المحفزات وأحداث جديدة وعلاقاتهم مع بعضهم البعض. حتى في بيئة مألوفة، مثل المنزل، هو واحد سريع للكشف عن تغيرات في العلاقات بين المثيرات لأن هذه التغيرات قد تكون التنبؤية للأحداث ذات مغزى. هذا التحفيز التحفيز (أي العلائقية) التعلم ينطوي على نحفظ من المحفزات متعددة وتقليديا يرتبط الحصين، الذي يقيم مركزيا في الفص الصدغي وسطي 4. ومع ذلك، لا توجد الحصين ولا تعمل في عزلة. المناطق القشرية داخل وخارج على حد سواءجانب من الفص الصدغي وسطي توفير المعلومات الحسية حاسمة لتشكيل الحصين 5-7. وتوفر دراسات التقليدية الآفة دائمة أدلة دامغة على تورط عدد من المناطق القشرية (مثل القشور خلف الطحال، postrhinal والمخية الأنفية الداخلية) في التعلم المعتمد على الحصين لكنها محدودة في قدرتها على تمييز دور منطقة معينة خلال مراحل منفصلة من تعلم 10/08.
هذا البروتوكول باختبار فرضية أن RSC من الضروري للتعلم التحفيز التحفيز بإسكات RSC خلال مرحلة واحدة من 3 مراحل شروط مسبقة الحسي النموذج 11،12. لفترة وجيزة، الفئران تتلقى دفعات من AAV التي تحتوي على مستقبلات مصمم و~ 3 أسابيع في وقت لاحق تدار المصمم المخدرات (CNO) 30 دقيقة قبل بدء الاختبار السلوكي. في هذا البروتوكول، فئران التجارب تتلقى CNO خلال المرحلة الأولى من اختبار (عندما لير التحفيز التحفيزنينغ يحدث) وأنها تتلقى السيارة خلال المراحل القادمة 2 من الاختبار. للسيطرة على الآثار غير المقصودة من CNO على السلوك، ولبث الفئران مع المصمم مستقبلات (hM4Di) وحقن مع السيارة بدلا من CNO. لحساب الآثار العامة من ضخ الفيروسي ومستقبلات التعبير، ولبث فيروس التحكم التي لا تحتوي على مستقبلات مصمم وإدارة CNO.
ويستخدم عدد من الأنماط المصلية مختلفة من AAV لتقديم المادة الوراثية. المبادئ التوجيهية الحالية NIH للبحوث إشراك المؤتلف أو الجزيئات الاصطناعية تؤكد أن AAV (جميع الأنماط المصلية) ويبني AAV المؤتلف أو الاصطناعية، والتي التحوير لا ترميز إما منتج جيني يحتمل أن يكون مكون للأورام أو جزيء السموم وتنتج في حالة عدم وجود فيروس المساعد، تتطلب BSL-1 الاحتياطات (مجموعة الملحق B-1. المخاطر 1 (RG1) وكلاء) 13. تتوفر 14،15 عدد من الاستعراضات المتعلقة بنية AAV، والمرافق والسلامة. والجدير بالذكر، على الرغم من، بسبب مخاوف تتعلق الممكنة والمحتملة 16،17 الآليات المسببة للسرطان الإنجابية 18-20 في القوارض وبعض المؤسسات تتطلب استخدام BSL-2 الاحتياطات عند العمل مع AAV. التحقق من BSL المناسب قبل استخدامها من خلال التشاور مع لجان الرقابة في المؤسسات الفردية حيث سيتم إجراء البحوث، ومراكز السيطرة على الأمراض والمبادئ التوجيهية NIH للبحوث إشراك المؤتلف DNA الجزيئات 13 عند استخدام ناقلات فيروسية للتلاعب الجيني في الولايات المتحدة. يتم تحديد الحماية الشخصية، والتدريب محقق، ناقلات الاحتواء، وإزالة التلوث، والتخلص من المواد تطهيرها، وبعد حقن الحيوان متطلبات السكن من خلال هذه المبادئ التوجيهية. وبالإضافة إلى ذلك، يجب استشارة والمتابعة المناسبة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية لجنة أو المبادئ التوجيهية لجنة الرقابة المؤسسية تعادل لضمان سلامة التعامل والإدارة والتخلص من AAV.
يصف هذا البروتوكول كيفية تطبيق نهج pharmacogenetic (DREADD) لمعرفة كيف تساهم منطقة محددة في الدماغ على مراحل متعددة المهام المعقدة التعلم. مع القدرة على مؤقتا وبعد إسكات النشاط العصبي في مناطق الدماغ منفصلة عبر مراحل التعلم، وهذا المزيج من النهج يوفر منبرا للتحقيق في مجموعة وا…
The authors have nothing to disclose.
نشكر واضعي روبنسون وآخرون. (12) لمساهماتها في المخطوطة التي يستمد جزئيا هذا البروتوكول.
Male, Long Evans Rats, 55-60 d | Hilltop Lab Animals Inc | ||
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
Clozapine-N-Oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer Drug |
Rat Cage lid (Polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion |
Filer Paper (Replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
Table Top Vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
Medline Biohazard liners | Staples | 113444 | Biohazard Trash Bags |
United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | Amazon.com | Biohazard Trash Can | |
Isoflurane, 100 mL | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
Anesthesia Mask (Rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
Automated Syringe pump with Micro4 Controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
Betadine Skin Cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
Triple Antiobiotic Ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
Puralube Vet Ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
28 Gauge 10uL Syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22'Wx22"Hx16"D |
Extra Tall Modular Test Chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
Stainless Steel Grid Floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
House Light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
Modular Pellet Dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
Pellet Recetacle, Cup Type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
Head Entry Detector for Rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
Cage Speaker for Rat Chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
Programmable Audio Generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
Smart Ctrl 8 Input/16 output Package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
Large Table Top Cabinet and Power Supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
PCI Interface Package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
Anti-Rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
Superfrost Plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |