This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.
Ce protocole décrit comment faire taire temporairement et à distance l'activité neuronale dans des régions discrètes du cerveau tandis que les animaux sont engagés dans des tâches d'apprentissage et de mémoire. L'approche combine la pharmacogénétique (Designer-récepteurs-Exclusivement-Activé par Designer-drogues) avec un paradigme comportemental (préconditionnement sensorielle) qui est conçu pour distinguer entre les différentes formes d'apprentissage. Plus précisément, la livraison médiée viral est utilisé pour exprimer un récepteur du G-protéine inhibitrice génétiquement modifié couplé (designer Receptor) dans une région du cerveau discret dans le rongeur. Trois semaines plus tard, lorsque les niveaux d'expression des récepteurs de concepteur sont élevés, un agent pharmacologique (designer drogues) est administré par voie systémique 30 min avant une session de comportement spécifique. Le médicament a une affinité pour le récepteur de créateur et, par conséquent conduit à l'inhibition des neurones qui expriment le récepteur de concepteur, mais est par ailleurs biologiquement inerte. La région du cerveau reste réduit au silence pour 2-5 heures (Depending de la dose et la voie d'administration). À la fin du paradigme comportemental, le tissu cérébral est évaluée pour le placement correct et l'expression du récepteur. Cette approche est particulièrement utile pour déterminer la contribution des différentes régions du cerveau à des composants spécifiques de comportement et peut être utilisé dans un certain nombre de paradigmes comportementaux.
Un défi passionnant dans le domaine de la neuroscience comportementale est de déterminer les substrats neuronaux de comportements complexes. Un certain nombre de techniques telles que des lésions permanentes au cerveau, l'inactivation temporaire par implants de canules et optogénétique ont été utilisées pour identifier les contributions des régions discrètes du cerveau à sous-composantes de comportements complexes. Bien que ces approches informent notre compréhension de la spécificité régionale lors de l'apprentissage, chaque technique est pas sans limites. Plus précisément, les lésions permanentes sont généralement menées avant le test comportemental, ainsi leurs effets sont présents tout au long de la durée du paradigme. études de canulation qui impliquent la présentation d'un inactivateur de neurones à court terme (par exemple, la tétrodotoxine) peut produire des dommages importants aux tissus du cerveau et peut induire un stress chez les sujets juste avant les tests de comportement. En outre, l'inactivation par insertion de canule est limitée à la région de tissu qui entoure lapointe de la canule. Enfin, tout en optogénétique propose une gamme de flexibilité pour le contrôle temporel de l'activité dans des régions spécifiques du cerveau, il est coût prohibitif et techniquement exigeant.
Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant une approche pharmacogénétique (Designer-récepteurs-Exclusivement-Activé par Designer-drogues, DREADDs) 1,2. Surtout, alors que le concept de la pharmacogénétique est sophistiqué, l'exécution de la technique est simple. Similaires à des méthodes chirurgicales stéréotaxiques traditionnels qui impliquent infusion de la toxine (par exemple, NMDA, l'acide iboténique) dans les régions du cerveau discrètes, cette technique implique l'infusion d'un virus adéno-associé (AAV) qui contient un fragment d'ADN d'un récepteur du G-protéine inhibitrice modifié couplée (hM4Di; le récepteur de designer) dans la région d'intérêt des rongeurs de laboratoire standard (voir Figure 1). Le vecteur viral contient également un rapporteur fluorescent (de mcitrine). Une fois incorporé danspour les cellules, le récepteur de concepteur (et protéine rapporteur) sont au maximum exprimé ~ 3 semaines après la perfusion et peuvent être activés sélectivement pour 2-5 heures par l'administration systémique du médicament concepteur contraire biologiquement inerte, la clozapine N-oxyde (CNO) 1 , 3. Parce que l'expérimentateur est doté de contrôle temporel précis, encore à distance sur l'activité neuronale dans des régions spécifiques du cerveau, la pharmacogénétique combine particulièrement bien avec les paradigmes comportementaux qui sont menées en plusieurs phases. Dans cet exemple, la contribution du cortex rétrosplénial (RSC) au stimulus stimulus apprentissage est comparé à son rôle dans l'apprentissage pavlovien, mais cette combinaison d'approches est bien adapté à un certain nombre de questions qui visent à déterminer comment les régions spécifiques du cerveau contribuent à comportement complexe.
En outre, bien que non décrite dans le présent protocole, les approches virales et transgéniques peuvent être utilisés pour atteindre cellule spécifique de type DREADD expression 2. Comme is inhérente à paradigmes comportementaux qui impliquent pharmacologiques et / ou d'autres types de manipulations expérimentales, un examen attentif de la conception expérimentale et l'analyse quantitative ultérieure est nécessaire lors de l'utilisation de l'approche DREADD. Expérimentateurs nouvelles à l'approche DREADD sont renvoyés à un examen complet de la technologie de DREADD actuelle 2.
Chaque jour, les organismes apprennent de nouveaux stimuli et les événements et leurs relations les uns aux autres. Même dans un environnement familier, comme la maison, on est prompt à détecter des altérations dans les relations entre les stimuli parce que ces changements peuvent être un facteur prédictif d'événements significatifs. Tel stimulus stimulus (ie, relationnelle) apprentissage implique la conjonction de multiples stimuli et a toujours été associée à l'hippocampe, qui réside au centre du lobe temporal médial 4. Cependant, ne existe pas l'hippocampe, ni agir dans l'isolement; régions corticales à l'intérieur et à l'extérieurcôté du lobe temporal médian fournir des informations sensorielles critique pour la formation hippocampique 7.5. Études de lésions permanentes traditionnels fournissent des preuves convaincantes de la participation d'un certain nombre de régions corticales (par exemple, les cortex rétrosplénial, postrhinal et entorhinal) dans l'apprentissage de l'hippocampe-dépendante, mais sont limités dans leur capacité à discerner le rôle d'une région en particulier lors des phases distinctes de apprentissage 8-10.
Le présent protocole teste l'hypothèse que la SRC est nécessaire pour l'apprentissage de stimulus-relance en faisant taire la SRC au cours d'une seule phase d'un 3-phase de préconditionnement sensorielle paradigme 11,12. En bref, les rats reçoivent des perfusions d'un AAV qui contient le récepteur de concepteur et ~ 3 semaines plus tard sont administré le concepteur médicament (CNO) 30 min avant le début des tests comportementaux. Dans le présent protocole, les rats expérimentaux reçoivent CNO lors de la première phase de test (lorsque stimulus stimulus LearNing se produit) et ils reçoivent véhicule pendant les deux prochaines phases de test. Pour contrôler les effets involontaires des CNO sur le comportement, infuser rats avec le récepteur de concepteur (hM4Di) et injecter avec le véhicule à la place du CNO. Pour tenir compte des effets généraux de perfusion virale et l'expression du récepteur, insuffler un virus de contrôle qui ne contient pas le récepteur de concepteur et administrer CNO.
Un certain nombre de différents serotypes de l'AAV sont utilisées pour fournir le matériel génétique. Les NIH Guidelines actuelles pour la recherche impliquant recombinant ou des molécules synthétiques soutient que l'AAV (tous les sérotypes) et constructions de AAV recombinants ou synthétiques, dans lequel le transgène ne code pas non plus un produit de gène potentiellement tumorigène ou une molécule de la toxine et sont produites en l'absence d'un virus auxiliaire, exige BSL-1 (groupe précautions Annexe B-1. risque 1 (RG1) Agents) 13. Un certain nombre de critiques se rapportant à la structure de l'AAV, l'utilité et la sécurité sont disponibles 14,15. En particulier, bien que, En raison de préoccupations relatives à 16,17 et potentiels mécanismes cancérogènes possibles sur la reproduction 18-20 chez les rongeurs, certains établissements exigent l'utilisation de BSL-2 précautions lorsque vous travaillez avec AAV. Vérifiez la BSL appropriée avant d'utiliser en consultation avec les comités de surveillance dans les établissements individuels où la recherche sera menée, les Centers for Disease Control et les lignes directrices des NIH pour la recherche impliquant l'ADN recombinant molécules 13 lors de l'utilisation de vecteurs viraux pour la manipulation génétique aux États-Unis. Les besoins en logement de protection individuelle, formation des enquêteurs, vecteur confinement, décontamination, l'élimination des matériaux décontaminés, animales et post-injection sont spécifiées par ces directives. En outre, consulter et suivre appropriée institutionnel de protection des animaux et utilisation des lignes directrices du comité ou des directives équivalentes du comité de surveillance institutionnels pour assurer la manipulation, l'administration et la disposition de l'AAV.
Ce protocole décrit comment appliquer une approche pharmacogénétique (DREADD) d'étudier comment une région spécifique du cerveau contribue à une tâche d'apprentissage complexe multi-phase. Avec la possibilité de faire taire temporairement et à distance l'activité neuronale dans des régions discrètes du cerveau à travers les phases de l'apprentissage, cette combinaison d'approches fournit une plate-forme pour enquêter sur un large éventail de comportements, y compris les formes plus nu…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les auteurs de Robinson et al. 12 pour leurs contributions à le manuscrit à partir de laquelle ce protocole est partiellement dérivé.
Male, Long Evans Rats, 55-60 d | Hilltop Lab Animals Inc | ||
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
Clozapine-N-Oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer Drug |
Rat Cage lid (Polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion |
Filer Paper (Replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
Table Top Vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
Medline Biohazard liners | Staples | 113444 | Biohazard Trash Bags |
United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | Amazon.com | Biohazard Trash Can | |
Isoflurane, 100 mL | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
Anesthesia Mask (Rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
Automated Syringe pump with Micro4 Controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
Betadine Skin Cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
Triple Antiobiotic Ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
Puralube Vet Ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
28 Gauge 10uL Syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22'Wx22"Hx16"D |
Extra Tall Modular Test Chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
Stainless Steel Grid Floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
House Light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
Modular Pellet Dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
Pellet Recetacle, Cup Type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
Head Entry Detector for Rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
Cage Speaker for Rat Chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
Programmable Audio Generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
Smart Ctrl 8 Input/16 output Package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
Large Table Top Cabinet and Power Supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
PCI Interface Package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
Anti-Rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
Superfrost Plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |