학습의 개별 단계에서 설치류에서 원격 음소거 신경 활동하는 방법
Summary
This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.
Abstract
이 프로토콜은 동물이 학습과 기억 작업에 종사하는 동안 일시적으로 원격으로 분리 된 뇌 영역에서 신경 세포의 활동을 침묵하는 방법에 대해 설명합니다. 접근 방식은 결합 약물 유전학 (디자이너 – 수용체가-전용 활성화별로 디자이너 – 약) 행동 패러다임 (감각 컨디셔닝)와 학습의 다양한 형태를 구분하기 위해 설계되었습니다. 즉, 바이러스 – 매개 전달은 유전자 변형 억제 G 단백질 결합 수용체 설치류 뇌에서 분리 된 영역으로 (디자이너 수용체)를 표현하기 위해 사용된다. 디자이너 수용체 발현 수준이 높은 경우 3 주 후, 약물 제 (디자이너 약물) 사전 행동 특정 세션에 30 분을 전신적으로 투여된다. 약물은 디자이너 수용체 친 화성을 가지며, 따라서 디자이너 수용체를 발현 신경의 억제를 초래하지만, 그 생물학적으로 불활성이다. 뇌 영역 (2-5 시간 동안 침묵에 의존적 유지땡) 투여 량 및 투여 경로에. 행동 패러다임 종료 후 뇌 조직은 정확한 배치와 수용체 발현에 대해 평가된다. 이러한 접근 방법은 동작의 특정 구성 요소에 대한 각각의 뇌 영역의 기여를 결정하는 행동 패러다임의 번호에 걸쳐 사용할 수있는 특히 유용하다.
Introduction
행동 신경 과학 분야 내 흥분 도전 복잡한 행동 신경 기판을 결정하는 것이다. 그러한 고정 병변, 캐 뉼러를 통해 임시 임플란트 뇌 비활성화 및 optogenetics 같은 수많은 기술 복잡한 행동 부성분 이산 뇌 영역의 기여를 식별하기 위해 사용되어왔다. 이러한 접근 방식은 학습 기간 동안 지역 특이성에 대한 우리의 이해를 통보하면서, 각각의 기술은 한계가없는 것은 아니다. 특히, 영구적 병변은 일반적으로, 따라서 그 효과는 패러다임의 기간에 걸쳐 존재하는, 행동 시험 전에 실시하고 있습니다. 뇌 조직에 상당한 손상을 일으킬 수있는 단기 신경 inactivator (예를 들어, 테트로도톡신)의 프리젠 테이션을 포함하고 직전 행동 테스트에 대한 주체의 스트레스를 유도 할 수 삽관 연구. 또한, 삽관 통해 불 활성화를 둘러싼 조직의 영역에 한정되어캐 뉼러의 끝. optogenetics 특정 뇌 영역에서 활동의 시간적 제어를위한 유연성을 제공하면서 마지막으로, 그것은 비용 금지 및 기술적 요구하고있다.
이러한 제한은 약물 유전 학적 접근 (디자이너 – 수용체 – 전용 활성화별로 디자이너 – 마약, DREADDs) 1, 2를 사용하여 극복 할 수 있습니다. 약물 유전학의 개념은 복잡하면서 중요한 것은, 상기 기술의 실행은 간단하다. 변형 억제 G 단백질 결합 수용체에 대한 DNA 단편을 포함 독소 (예, NMDA, ibotenic 산) 이산 뇌 영역으로는,이 기술은 아데노 – 관련 바이러스 (AAV)를 주입하는 것을 포함의 주입을 포함하는 전통적인 정위 수술 방법과 유사하게 (hM4Di, 디자이너 수용체) 표준 실험실 설치류의 관심 영역으로는 (그림 1 참조). 바이러스 벡터는 형광 기자 (mcitrine)가 포함되어 있습니다. 에 통합되면세포에, 디자이너 수용체 (리포터 단백질) 최대한 ~ 삼주 후 주입을 표현하고 선택적으로 다른 생물학적으로 불활성 디자이너 약물의 전신 투여, 클로자핀-N- 옥사이드로 2-5 시간 동안 활성화 할 수 있습니다 (CNO) 1 , 3. 실험은 특정 뇌 영역에서 신경 활동을 정밀하게, 아직 원격 제어 시간을 부여하기 때문에, 약물 유전학은 여러 단계로 진행됩니다 행동 패러다임에 특히 잘 결합한다. 이 예에서, retrosplenial 피질의 기여 (RSC)은 자극 – 자극하는 학습이 파블로프 학습에서의 역할과 비교된다, 그러나 접근 방식의 조합은 뇌 영역에 기여하는 방법을 특정 식별을 추구 질문의 수에 적합하다 복잡한 행동.
본 프로토콜에 설명되지하면서 또한, 바이러스 및 형질 전환 방법은 세포 형 특이 DREADD 식 (2)를 달성하기 위해 사용될 수있다. 나는DREADD 접근 방식을 사용하는 경우의 고유 실험 조작, 실험 설계 및 후속 정량 분석의주의 깊은 고려의 약리학 및 / 또는 다른 유형을 포함하는 행동 패러다임이 필요합니다. DREADD 접근 방식에 새로운 실험자은 현재 DREADD 기술 2의 종합적인 검토라고합니다.
매일, 생물은 새로운 자극과 이벤트와 서로의 관계에 대해 알아 봅니다. 도 친숙한 환경에서, 이러한 가정으로, 하나는 이러한 변경의 의미있는 사건 예측 될 수 있기 때문에 자극 사이의 관계의 변화를 검출하기 위해 빠른 것이다. 이러한 자극 – 자극 (즉, 관계형) 학습은 여러 자극들이 결합되어 포함 전통적으로 내측 측두엽 4에서 중앙 상주하는 해마와 관련이있다. 그러나, 해마 존재도 단독으로 작용하지 않는다; 내부와 외부 모두 대뇌 피질의 영역내측 측두엽의 측면은 해마 형성 5-7에 중요한 감각 정보를 제공합니다. 전통 영구적 병변 연구는 해마에 의존하는 학습 대뇌 피질의 영역 (예를 들어,, retrosplenial postrhinal 및 entorhinal 피질)의 수의 참여에 대한 강력한 증거를 제공하지만 이산 단계에서 특정 지역의 역할을 식별 할 수있는 능력에 제한이 8-10 학습.
본 프로토콜은 RSC는 3 상 감각 전처리 패러다임 (11, 12)의 단일 단계에서 RSC를 침묵에 의해 자극 – 자극 학습에 필요한 가설을 테스트합니다. 간단히 말해서, 쥐 디자이너 수용체를 포함하고 2 ~ 3 주 후에 행동 테스트를 시작하기 전에 디자이너 약물 (CNO) 30 분 관리되는 AAV의 주입을받을 수 있습니다. 본 프로토콜에서는, 실험 쥐 시험의 첫 번째 단계 (자극 – 자극 리어 동안 CNO를받을닝 발생)하고는 시험의 다음 2 단계에서 차량을받을 수 있습니다. 행동에 CNO의 부주의 효과를 제어하기 위해, 디자이너 수용체 (hM4Di)와 쥐를 주입 대신 CNO의 차량에 주입. 바이러스 주입 및 수용체 발현의 일반적인 효과를 설명하기 위해, 설계자 수용체를 포함하고 CNO를 관리하지 않는 제어 바이러스 달이다.
AAV의 상이한 혈청 형의 개수는 유전 물질을 전달하는 데 사용된다. 재조합 또는 합성 분자를 포함하는 연구 현재 NIH 지침 트랜스가 잠재적 종양 유전자 생성물 또는 독소 분자를 인코딩하지 않고의 부재하에 제조되는 것을 AAV (모든 혈청 형) 및 재조합 또는 합성 AAV 구조체를 유지 헬퍼 바이러스, BSL-1의주의 사항 (부록 B-1. 위험 그룹 1 (RG1) 에이전트) (13)을 필요로한다. AAV 구조, 유틸리티 및 안전에 관한 리뷰의 숫자는 14, 15 사용할 수 있습니다. 특히,하지만AAV 작업을 할 때, 설치류에서 가능한 생식 16, 17 및 잠재적 발암 메커니즘을 18 ~ 20에 관한 우려로 인해, 일부 기관은 BSL-2주의의 사용을 필요로한다. 연구는 질병 통제 및 미국의 유전자 조작에 바이러스 벡터를 사용하는 경우 재조합 DNA 분자 (13)를 포함하는 연구에 대한 NIH 가이드 라인, 센터를 실시한다 개별 기관의 감독위원회와 협의하여 사용하기 전에 해당 BSL을 확인합니다. 개인 보호, 연구자 훈련, 벡터 봉쇄, 오염 제거, 오염 제거 물질의 처분 및 사후 주입 동물 주택의 요구 사항은이 지침에 의해 지정됩니다. 또한, 상담 및 적절한 기관 동물 관리를 수행하고, 안전한 취급, 관리 및 AAV의 처분을 보장하기 위해위원회의 지침 또는 이와 동등한 기관 감독위원회 지침을 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 특정 뇌 영역이 다단계 복잡한 학습 과제에 기여하는 방법을 조사하기 위해 약물 유전 학적 접근 (DREADD)를 적용하는 방법에 대해 설명합니다. 일시적으로 원격 학습 단계에 걸쳐 이산 뇌 영역에서의 신경 활성을 침묵하는 기능, 방법의 조합 학습의 미묘한 차이 또는 마스크 형태를 포함 행동의 넓은 범위를 조사 할 수있는 플랫폼을 제공한다. 이 프로토콜에 설명 된 예에서, retrosplen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 프로토콜이 부분적으로 파생 된 원고에 대한 그들의 공헌 로빈슨 등. (12)의 저자 감사합니다.
Materials
| Male, Long Evans Rats, 55-60 d | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-Oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer Drug |
| Rat Cage lid (Polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion |
| Filer Paper (Replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table Top Vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Medline Biohazard liners | Staples | 113444 | Biohazard Trash Bags |
| United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | Amazon.com | Biohazard Trash Can | |
| Isoflurane, 100 mL | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia Mask (Rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated Syringe pump with Micro4 Controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine Skin Cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple Antiobiotic Ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube Vet Ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 Gauge 10uL Syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22'Wx22"Hx16"D |
| Extra Tall Modular Test Chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless Steel Grid Floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House Light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular Pellet Dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet Recetacle, Cup Type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head Entry Detector for Rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage Speaker for Rat Chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable Audio Generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart Ctrl 8 Input/16 output Package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large Table Top Cabinet and Power Supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI Interface Package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-Rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost Plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
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