This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.
Denne protokollen beskriver hvordan du midlertidig og tele taushet neuronal aktivitet i diskrete områder av hjernen mens dyrene er engasjert i læring og hukommelse oppgaver. Tilnærmingen kombinerer Farmakogenetikk (Designer-reseptor-Eksklusivt-Aktivert-by-Designer-Drugs) med en atferds paradigmet (sensorisk preconditioning) som er utviklet for å skille mellom ulike former for læring. Spesifikt blir viral-mediert levering brukt for å uttrykke en genetisk modifisert inhiberende G-proteinkoblet reseptor (designeren Receptor) inn i en diskret hjerneregionen i gnagere. Tre uker senere, da designer reseptor uttrykk nivåer er høy, er en farmakologisk agent (Designer Drug) administreres systemisk 30 min før en bestemt atferds økt. Stoffet har affinitet for designeren reseptoren og dermed resulterer i hemming av nevroner som uttrykker designer reseptoren, men er ellers biologisk inert. Hjernen regionen forblir stille på tribunen i 2-5 timer (DEPENding av dose og administrasjonsveien). Ved ferdigstillelse av atferds paradigme, er hjernevev vurderes for riktig plassering og reseptor uttrykk. Denne fremgangsmåten er spesielt nyttig for å bestemme bidraget av de enkelte områder av hjernen til bestemte komponenter i oppførsel og kan brukes på tvers av hvilket som helst antall av atferds paradigmer.
En spennende utfordring innen biologisk psykologi er å bestemme nevrale substrater av komplekse atferd. En rekke teknikker som permanente skader, midlertidig hjernen inaktivering via kanyler implantater og optogenetics har blitt ansatt for å identifisere innsatsen til diskrete områder av hjernen til subkomponenter av komplekse atferd. Mens disse tilnærmingene informere vår forståelse av regional spesifisitet under læring, er hver teknikk ikke uten begrensninger. Spesielt er permanente skader typisk utført før adferdstesting, og dermed deres virkninger er til stede under hele paradigmet. Kanylering studier som involverer fremstilling av en kortvarig neural inaktivator (for eksempel tetrodotoksin) kan gi betydelig skade på vev i hjernen og kan forårsake stress hos personer like før adferdstesting. Videre er inaktivering ved kanylering begrenset til det område av vev som omgirspissen av kanyler. Til slutt, mens optogenetics tilbyr et utvalg av fleksibilitet for den tidsmessige kontroll av aktivitet i bestemte områder av hjernen, er det kostnadene prohibitive og teknisk krevende.
Disse begrensningene kan overvinnes ved hjelp av en farmakogenetiske tilnærming (Designer-reseptor-Eksklusivt-Aktivert-by-Designer-Drugs, DREADDs) 1,2. Viktigere, mens begrepet Pharmacogenetics er sofistikert, er utførelsen av teknikken ukomplisert. I likhet med tradisjonelle stereotaksiske kirurgiske metoder som involverer tilførsel av toksin (for eksempel, NMDA, ibotensyre) i diskrete hjerneområder, innebærer denne teknikk å tilføre et adeno-assosiert virus (AAV) som inneholder et DNA-fragment for en modifisert inhiberende G-proteinkoblet reseptor (hM4Di; konstruktøren reseptor) inn i området av interesse av standard laboratorie gnagere (se figur 1). Den virale vektoren inneholder også et fluorescerende reporter (mcitrine). Når innlemmet itil celler, er den designer reseptor (og reporter protein) maksimalt uttrykt ~ 3 uker post-infusjon og kan aktiveres selektivt i 2-5 timer ved systemisk administrering av den ellers biologisk inert designer medikament, Clozapine-N-oksyd (CNO) 1 3. Fordi eksperimentator er utstyrt med presis, men fjerntemporal kontroll over nevrale aktiviteten i bestemte områder av hjernen, og kombinerer Farmakogenetikk spesielt godt med atferds paradigmer som er gjennomført i flere faser. I dette eksemplet til bidraget fra den retrosplenial cortex (RSC) stimulus-stimulus læring i forhold til sin rolle i Pavlovian læring, men denne kombinasjonen av metodene er godt egnet til en rekke spørsmål som søker å identifisere hvordan spesifikke områder av hjernen bidra til kompleks oppførsel.
I tillegg, selv om det ikke er beskrevet i den foreliggende protokoll, virale og transgene metoder kan brukes for å oppnå celletype-spesifikk ekspresjon DREADD 2. Som jegs iboende i adferds paradigmer som omfatter farmakologiske og / eller andre typer eksperimentelle manipulasjoner, en nøye vurdering av eksperimentell design og påfølgende kvantitativ analyse er nødvendig når man anvender den DREADD tilnærming. Experimenters nye til DREADD tilnærming blir henvist til en omfattende gjennomgang av dagens DREADD teknologi 2.
Hver dag, organismer lære om nye stimuli og hendelser og deres forhold til hverandre. Selv i et kjent miljø, for eksempel hjemme, er en rask til å oppdage endringer i relasjonene mellom stimuli fordi disse endringene kan være prediktiv for meningsfulle hendelser. Slik stimulus-stimulus (dvs. relasjons) innebærer læring på conjoining av flere stimuli og har tradisjonelt vært forbundet med hippocampus, som ligger sentralt i den mediale tinninglappen fire. Imidlertid ikke hippocampus eksisterer heller ikke opptre isolert; kortikale regioner både innenfor og utenforside av den mediale tinninglappen tilveiebringe kritisk sensorisk informasjon til hippokampalformasjonen 5-7. Tradisjonelle permanente lesjon studier gir overbevisende bevis for involvering av en rekke kortikale regioner (f.eks retrosplenial, postrhinal og entorhinal cortex) i hippocampus-avhengig læring, men er begrenset i sin evne til å skjelne rollen som en bestemt region under diskrete faser av læring 8-10.
Protokoll tester hypotesen om at RSC er nødvendig for stimulus-stimulus læring ved å stanse RSC løpet av en enkelt fase av en 3-fase sensorisk preconditioning paradigme 11,12. Kort beskrevet, mottar rottene infusjoner av en AAV som inneholder designer reseptoren og ~ 3 uker senere administreres medikament til designeren (CNO) 30 min før starten av adferdstesting. I den foreliggende protokoll, eksperimentelle rotter motta CNO løpet av den første fasen av testing (når stimulus-stimulus learning forekommer), og de får bilen i løpet av de neste to fasene av testing. For å kontrollere for utilsiktede effekter av CNO på atferd, sette mot rotter med designer reseptor (hM4Di) og injisere med bilen i stedet for CNO. Å gjøre rede for generelle effekter av viral infusjon og reseptor uttrykk, sette mot en kontroll virus som ikke inneholder designer reseptoren og administrere CNO.
Et antall forskjellige serotyper av AAV brukes til å levere genetisk materiale. De nåværende NIH retningslinjer for forskning som omfatter rekombinant eller syntetiske molekyler holder at AAV (alle serotyper) og rekombinante eller syntetiske AAV konstruksjoner, der transgenet ikke koder enten en potensielt tumorigent genprodukt eller en toksinmolekylet og er produsert i fravær av en helper virus, krever BSL-en forholdsreglene (vedlegg B-1. Risk Group 1 (RG1) Agenter) 13. Et antall anmeldelser knyttet til AAV struktur, nytte og sikkerhet er tilgjengelig 14,15. Spesielt, men, På grunn av bekymringer knyttet til mulige reproduktive 16,17 og potensielle kreftfremkallende mekanismer 18-20 hos gnagere, enkelte institusjoner krever bruk av BSL-2 forholdsregler når du arbeider med AAV. Kontroller riktig BSL før bruk av konsulenttjenester med tilsynsutvalgene i enkeltinstitusjoner der forskningen vil bli gjennomført, Centers for Disease Control og NIH retningslinjer for forskning som involverer rekombinant DNA Molekyler 13 ved bruk av virale vektorer for genmanipulering i USA. Personlig verneutstyr, etterforsker trening, vektor containment, dekontaminering, disponering av dekontaminert materialer, og etter injeksjon dyreboligbehov er spesifisert av disse retningslinjene. I tillegg konsultere og følg passende Institutional Animal Care og retningslinjer for bruk av komité eller tilsvarende institusjonelle retningslinjer forglemmelse komité for å sikre trygg håndtering, forvaltning og disponering av AAV.
Denne protokollen beskriver hvordan du bruker en farmakogenetiske tilnærming (DREADD) for å undersøke hvordan en bestemt hjernen regionen bidrar til en flerfase kompleks læring oppgave. Med muligheten til å midlertidig og tele taushet nevrale aktiviteten i diskrete områder av hjernen over faser av læring, gir denne kombinasjonen av tilnærminger en plattform for å undersøke et bredt spekter av atferd, inkludert mer nyanserte eller maskerte læringsformer. I det eksempel som er beskrevet i denne protokollen, kon…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker forfatterne av Robinson et al. 12 for deres bidrag til manuskriptet som denne protokollen er delvis avledet.
Male, Long Evans Rats, 55-60 d | Hilltop Lab Animals Inc | ||
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
Clozapine-N-Oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer Drug |
Rat Cage lid (Polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion |
Filer Paper (Replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
Table Top Vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
Medline Biohazard liners | Staples | 113444 | Biohazard Trash Bags |
United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | Amazon.com | Biohazard Trash Can | |
Isoflurane, 100 mL | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
Anesthesia Mask (Rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
Automated Syringe pump with Micro4 Controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
Betadine Skin Cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
Triple Antiobiotic Ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
Puralube Vet Ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
28 Gauge 10uL Syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22'Wx22"Hx16"D |
Extra Tall Modular Test Chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
Stainless Steel Grid Floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
House Light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
Modular Pellet Dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
Pellet Recetacle, Cup Type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
Head Entry Detector for Rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
Cage Speaker for Rat Chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
Programmable Audio Generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
Smart Ctrl 8 Input/16 output Package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
Large Table Top Cabinet and Power Supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
PCI Interface Package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
Anti-Rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
Superfrost Plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |