Öğrenmenin Ayrık Aşama sırasında Kemirgenler uzaktan suskunluğu Sinir Aktivitesi Bir Yöntem
Summary
This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.
Abstract
Bu protokol hayvanların öğrenme ve bellek işlerle meşgul iken geçici ve uzaktan ayrık beyin bölgelerinde nöronal aktivitenin susturmak açıklamaktadır. yaklaşım birleştiren farmakogenetik (Tasarımcı-Reseptörler-Münhasıran-Aktif-by-Designer-İlaçlar) bir davranış paradigma (duyusal önkoşullama) ile öğrenmenin farklı biçimlerde ayırt üzere tasarlanmıştır. Spesifik olarak, viral kaynaklı dağıtım, bir genetik olarak tadil edilmiş inhibe edici G-protein bağlı reseptör kemirgen içinde ayrı bir beyin bölgesine (tasarımcı Reseptör) ifade etmek için kullanılır. Tasarımcı reseptör ekspresyon düzeyleri yüksek olduğunda Üç hafta sonra, bir farmakolojik ajan (Tasarımcı İlaç) önce belirli bir davranış oturuma sistemik 30 dakika uygulanır. ilaç tasarım reseptörü için afiniteye sahiptir ve bu nedenle tasarım reseptörünü eksprese eden nöronların inhibisyonu ile sonuçlanır, ancak aksi takdirde, biyolojik olarak inerttir. beyin bölgesi (2-5 saat susturulmuş vin kalırding) doz ve uygulama yoluna. Davranışsal paradigmanın tamamlayan beyin dokusu doğru yerleştirme ve reseptör ifadesi için değerlendirilir. Bu yaklaşım, davranış belirli bileşenleri tek tek beyin bölgelerinin katkı belirlenmesi ve davranışsal paradigmaların bir dizi boyunca kullanılabilir için özellikle yararlıdır.
Introduction
Davranışsal nörobilim alanında heyecan verici bir meydan okuma, karmaşık davranışlar nöral substratlar belirlemektir. Böyle kalıcı lezyonlar, kanüller implantlar yoluyla geçici beyin inaktivasyonu ve optogenetics olarak bir dizi teknik, karmaşık davranışlar alt bileşenleri ayrık beyin bölgelerinin katkıları belirlemek için kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar öğrenme sırasında bölgesel özgüllük anlayışımızı haberdar ederken, her teknik sınırlamaları olmadan değildir. Özellikle kalıcı lezyonlar genellikle böylece etkileri paradigma süresince mevcut, davranış testi öncesinde yapılmaktadır. Beyin dokusunda önemli bir hasar üretebilir kısa süreli sinir inaktivatör (örneğin, tetrodotoxin) sunumunu içeren ve hemen önce davranışsal test konularda strese neden olabilir kanülasyon çalışmaları. Bundan başka, kanülasyon yoluyla etkisiz hale getirilmesi çevreleyen doku bölgesi ile sınırlıdırkanül ucu. Optogenetics spesifik beyin bölgelerinde aktivitesi zamansal kontrolü için bir esneklik sunar ise Son olarak, bu maliyetlidir ve teknik olarak zor olduğu.
Bu sınırlamalar bir farmakogenetik yaklaşım (Tasarımcı-Reseptörler-Münhasıran-Aktif-by-Designer-İlaçlar, DREADDs) 1,2 kullanılarak aşılabilir. Farmakogenetik kavramı gelişmiş iken önemlisi, tekniğin yürütme basittir. Bir tadil edilmiş inhibitör G-proteine akuple bir reseptör için bir DNA fragmanını içeren bir toksin (örneğin, NMDA, ibotenik asit) ayn beyin bölgeleri içine, bu teknik, bir adeno-bağlantılı virüs (AAV) infüzyonu içerir infüzyonu içeren geleneksel bir stereotaksik cerrahi yöntemlere benzer (hM4Di; tasarımcı reseptörü) standart laboratuar kemirgenler ilgi bölgeye (Şekil 1). viral vektör, bir floresan haberci (mcitrine) içerir. Dahil kezhücrelere, tasarımcı reseptörü (ve raportör protein) maksimum ~ 3 hafta sonra infüzyon ifade edilir ve seçici olarak, aksi biyolojik olarak eylemsiz tasarım ilacın sistemik olarak uygulanması, klozapin-N-oksit ile 2-5 st için aktive edilebilir (CNO) 1 3. Deneyci, belirli beyin bölgelerinde nöral aktivitenin üzerinde kesin, ancak uzaktan kumanda zamansal sahip olduğundan, farmakogenetik birden aşamalarda yürütülen davranışsal paradigmalar ile özellikle de birleştirir. Bu örnekte, retrosplenial korteks katkısı (RSC) uyaran-uyaran öğrenme Pavlov öğrenmedeki rolü ile karşılaştırıldığında, ancak yaklaşımların bu kombinasyon beyin bölgelerinin nasıl katkıda özgü tespit etmeye sorulardan herhangi bir sayı için uygundur Karmaşık davranış.
Bu protokolde tarif edilmemiş ise ek olarak, viral ve transjenik yaklaşımlar hücre tipine spesifik DREADD ifade 2 elde etmek için kullanılabilir. IDREADD yaklaşımı kullanıldığında s doğasında deneysel manipülasyonlar, deneysel tasarım ve sonraki kantitatif analiz dikkatli dikkate farmakolojik ve / veya diğer türde içeren davranışsal paradigmalar gereklidir. DREADD yaklaşım yeni Deneyciler mevcut DREADD teknolojisi 2 kapsamlı bir inceleme adlandırılır.
Her gün, organizmalar yeni uyaranlara ve olayları ve birbirlerine olan ilişkileri hakkında bilgi edinin. Hatta tanıdık bir ortamda, örneğin ev, biri bu değişikliklerin anlamlı olayların tahmin olabilir, çünkü uyaranlara arasındaki ilişkilerde değişiklikler tespit etmek hızlıdır. Böyle bir uyaran-uyaran (örneğin, ilişkisel) öğrenme birden uyaranların conjoining içerir ve geleneksel medial temporal lobda 4 içinde merkezi bulunduğu hipokampus ile ilişkili olmuştur. Ancak, hipokampus var, ne de tek başına hareket etmez; içinde ve dışında hem kortikal bölgelermedial temporal lob yan hipokampal formasyon 5-7 kritik duyusal bilgi sağlar. Geleneksel kalıcı lezyon çalışmaları hipokampus bağımlı öğrenme kortikal bölgelere (örneğin, retrosplenial postrhinal ve entorinal korteks) bir dizi katılımı için ikna edici bir kanıt sağlar, ancak ayrı aşamalarında belirli bir bölgede rolünü ayırt etme yeteneği sınırlıdır 8-10 öğrenme.
Mevcut protokol RSC 3 fazlı duyusal önkoşullamasının paradigma 11,12 tek bir aşamasında RSC susturma yoluyla uyaran-uyaran öğrenme için gerekli olan hipotezini test eder. Kısaca, sıçanlar tasarım reseptörü içerir ve ~ 3 hafta sonra davranış testleri başlamadan önce tasarım madde (CNO) 30 dakika süresince verilir bir AAV infüzyonu yapılan. Mevcut protokolde, deneysel fareler test ilk aşamasında (uyarıcı-uyarıcı lear sırasında CNO alıyorsunuzning oluşur) ve test sonraki 2 aşamalarında aracı alırsınız. Davranışına CNO yanlışlıkla etkilerini kontrol etmek için, tasarım reseptörü (hM4Di) farelere süzülür ve bunun yerine CNO bir araç ile enjekte edilir. Viral infüzyon ve reseptör ifadesinin genel etkileri hesaba katmak için, tasarımcı reseptörü içeren ve CNO yönetmek değil bir kontrol virüsü demlenmeye.
AAV, farklı serotiplerin çok sayıda genetik bir malzeme uygulamak üzere kullanılır. rekombinant veya sentetik moleküllerini içeren Araştırma mevcut NIH Kılavuzu transgen potansiyel tümörijenik gen ürünü ya da bir toksin molekülü ya da kodlamak etmez ve yokluğunda üretildiği bu AAV (bütün serotipler) ve rekombinant ya da sentetik AAV yapıları korur Yardımcı virüs, BSL-1 önlemler (Ek B-1. Risk Grubu 1 (RG1) Acenteleri) 13 gerektirir. AAV yapısı, programı ve güvenlik ile ilgili yorumunun sayısı 14,15 mevcuttur. Özellikle, olsaAAV ile çalışırken, kemirgenlerde muhtemel üreme 16,17 ve potansiyel kanserojen mekanizmalar 18-20 ilişkin endişeler nedeniyle, bazı kurumlar BSL-2 önlemlerin kullanılmasını gerektirir. Araştırma Hastalık Kontrol ve ABD'de gen manipülasyonu için viral vektörler kullanılırken Rekombinant DNA Moleküller 13 İçeren Araştırma NIH Rehberi için, Merkezleri yapılacaktır bireysel kurumlarında gözetim komiteleri ile danışarak kullanımdan önce uygun BSL doğrulayın. Kişisel korunma, araştırmacı eğitimi, vektör çevreleme, dekontaminasyon, dekontamine malzemelerin imhası ve enjeksiyon sonrası hayvan barınağı gereksinimleri bu yönergelere göre belirlenir. Buna ek olarak, danışmak ve uygun Kurumsal Hayvan Bakım izleyin ve güvenli kullanım, yönetim ve AAV'nin bertarafını sağlamak için komite kurallarına veya eşdeğer kurumsal gözetim komitesi yönergeleri kullanın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, belirli bir beyin bölgesi çok fazlı karmaşık öğrenme görevi nasıl katkıda araştırmak için bir farmakogenetik yaklaşım (DREADD) uygulamak açıklamaktadır. Geçici ve uzaktan öğrenme aşamalarında farklı beyin bölgelerinde nöral aktiviteyi susturmak için yeteneği ile, yaklaşımların bu kombinasyon öğrenmenin daha nüanslı ve maskeli formları dahil olmak üzere davranışları geniş bir yelpazede, araştırmak için bir platform sağlar. Bu protokol açıklanan örnekte, retrosp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu protokol kısmen türediği yazının katkılarından dolayı Robinson ve ark., 12 yazarları teşekkür ederim.
Materials
| Male, Long Evans Rats, 55-60 d | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-Oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer Drug |
| Rat Cage lid (Polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion |
| Filer Paper (Replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table Top Vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Medline Biohazard liners | Staples | 113444 | Biohazard Trash Bags |
| United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | Amazon.com | Biohazard Trash Can | |
| Isoflurane, 100 mL | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia Mask (Rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated Syringe pump with Micro4 Controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine Skin Cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple Antiobiotic Ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube Vet Ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 Gauge 10uL Syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22'Wx22"Hx16"D |
| Extra Tall Modular Test Chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless Steel Grid Floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House Light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular Pellet Dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet Recetacle, Cup Type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head Entry Detector for Rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage Speaker for Rat Chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable Audio Generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart Ctrl 8 Input/16 output Package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large Table Top Cabinet and Power Supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI Interface Package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-Rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost Plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
- Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
- Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. . amnesia and the hippocampal system. , (1993).
- Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
- Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
- Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
- Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
- Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
- Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
- Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
- Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
- . NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
- Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
- Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
- Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
- Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
- . National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , (1996).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
- Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
- wiki, D. R. E. A. D. D. . , (2014).
- Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
- Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
- Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
- Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
- Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).
