Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.
Immun tolerance i graviditeten kræver, at immunsystemet hos moderen undergår markante ændringer for at acceptere og give næring fosteret udvikle. Denne tolerance er initieret under coitus, etableret under befrugtning og implantation, og opretholdes under hele graviditeten. Aktive cellulære og molekylære mediatorer af maternel-føtal tolerance er beriget på stedet for kontakt mellem føtale og maternelle væv, kendt som den maternelle-føtale interface, som omfatter moderkagen og livmoderen og decidua væv. Denne grænseflade består af stromale celler og infiltrerende leukocytter, og deres overflod og fænotypiske karakteristika ændres i løbet af graviditeten. Infiltrerende leukocytter på maternel-føtal grænseflade indbefatter neutrofiler, makrofager, dendritiske celler, mastceller, T-celler, B-celler, NK-celler og NKT-celler, der samlet udgør det lokale mikromiljø, som opretholder graviditet. En ubalance mellem disse celler eller enhver inappropriate ændring i deres fænotyper betragtes som en mekanisme for sygdom i graviditeten. Derfor studiet af leukocytter, der infiltrerer maternel-føtal interface er afgørende for at belyse de immune mekanismer, der fører til graviditetsrelaterede komplikationer. Beskrevet heri er en protokol, som anvender en kombination af forsigtig mekanisk dissociation efterfulgt af et robust enzymatisk disaggregering med et proteolytisk og collagenolytisk enzymatisk cocktail at isolere de infiltrerende leukocytter fra de murine væv ved maternel-føtal interface. Denne protokol muliggør isolering af høje antal af levedygtige leukocytter (> 70%) med tilstrækkelig konserverede antigene og funktionelle egenskaber. Isolerede leukocytter kan derefter analyseres ved adskillige teknikker, herunder immunfænotype, cellesortering, imaging, immunoblotting, mRNA-ekspression, cellekultur og in vitro funktionelle assays såsom blandede leukocyt reaktioner, proliferation eller cytotoksicitetsassays.
Immuntolerance i graviditeten er en periode, hvor markante ændringer forekommer inden immunsystemet hos moderen. Disse ændringer tillader moderen at tolerere fosteret, en semi-allogent transplantat 1. Fosteret udtrykker faderlige større histokompatibilitetskompleks (MHC) antigener 2, og fosterceller er blevet fundet i den maternelle cirkulation 3; imidlertid fosteret ikke afvist 4,5. Denne gåde er ikke fuldt forstået.
Den seneste hypotese, at maternel-føtal tolerance er skabt under coitus og befrugtning 6,7 og vedligeholdes for at opretholde en fuld sigt graviditet 8-10. En fordeling af dette maternel-føtal tolerance betragtes som en mekanisme for sygdom i tidlige og sene stadier af graviditeten 10-16. Maternel-føtal tolerance involverer deltagelse af forskellige leukocyt subpopulationer, herunder T-celler (regulerende T-celler, Th1-celler, Th2 celler og Th17 celler), macrophages, neutrofiler, mastceller, NK-celler, og NKT celler, dendritiske celler og B-celler, at ændring i tæthed og lokalisering hele graviditeten 15,17-19. Maternel-føtal tolerance er beriget på maternel-føtal grænseflade 20 – den anatomiske sted, hvor immunsystemet hos moderen interagerer med føtale antigener 20,21.
Den maternel-føtal interface er skabt under placentation når føtale extravillous trophoblastceller invadere slimhinden 22-24. På den føtale side af denne grænseflade, de membraner, der omgiver fosteret skabe en specialiseret epiteloverflade i moderkagen, og syncytiotrophoblast cellerne styrer udvekslingen af næringsstoffer gennem deres direkte kontakt med moderens blod 22. På moderens side af grænsefladen, decidua rekrutterer en heterogen pulje af leukocytter, som i mus udgør 30% til 50% af alle moderhindeceller. Ud over deres deltagelse i MATERNal immun tolerance, disse celler er vigtige bidragydere til forskellige processer under graviditeten, fx., beskyttelse af den reproduktive tarmkanalen fra infektioner, befrugtning, embryo implantation 7,25, decidua angiogenese 26, vaskulær remodellering 24,27, trofoblast invasion 28, placenta udvikling 24,25, og i sidste ende, arbejdskraft og levering 15,17. Derfor er studiet af de involverede i maternel-føtal tolerance leukocytter er afgørende for at belyse patogenesen af graviditetsrelaterede komplikationer.
Mens anvendelsen af immunhistokemi og immunfluorescens har genereret data til direkte visualisering og lokalisering af uterin, decidua eller placenta leukocytter 29,30, flowcytometri analyse har yderligere afsløret specifikke delmængder af leukocytter i hvert af disse væv 31,32. Derudover flowcytometri er blevet anvendt til bestemmelse af massefylde og andelen af maternal-føtal grænseflade leukocytter 33 og ekspressionsniveauer af ekstracellulære og intracellulære proteiner 8-10,34. Flowcytometrisk analyse af leukocytter ved maternel-føtal grænseflade kræver en enkelt-cellesuspension. For at isolere infiltrerende leukocytter fra decidua, livmoder og placenta væv, har to metoder til væv dissociation blevet anvendt: mekanisk og enzymatisk. Begge metoder tillader adskillelsen af infiltrerede leukocytter fra den ekstracellulære matrix (ECM), i disse væv. Enzymatisk væv dissociation er overlegen i forhold til mekanisk væv dissociation da det tillader et højere udbytte af leukocytter med mindre forskydningskraft-associeret skade 35. Derfor kræver mekanisk væv dissociation pooling væv 36, hvilket kan øge variationen og heterogenitet af prøverne. Alligevel kan mekanisk dissociation være valg, når antigenet af interesse kan ændres ved enzymatisk dissociation eller når funktionaliteten af cellens af interesse behov for at blive bevaret (f.eks., cytotoksicitet NK-celler) 35.
Anvendelsen af proteolyse med specifikke enzymer til at nedbryde ECM eliminerer de lave udbytter observeret med mekanisk dissociation. Flere undersøgelser har rapporteret brugen af trypsin 32, collagenase 37, DNase 31, dispase 38, og kommercielle cocktails af forskellige enzymer 32,39. Imidlertid må arten og koncentrationen af forskellige enzymer og varigheden af fordøjelsen blive omhyggeligt defineret og valideret for at sikre opretholdelse af integriteten af celleoverflade antigene epitoper, der kræves for immunfænotypebestemmelse. De forskellige overfladestrukturer er differentielt modtagelige for ødelæggelse af forskellige enzymer, med nogle enzymer, såsom trypsin, er berygtet for stripping leukocyt overflade epitoper genkendt af mange monoklonale antistoffer.
Indført heri er en fremgangsmåde under anvendelse af en proteolytic og collagenolytisk enzymatisk cocktail, kaldet Accutase. Denne enzymatiske opløsning er blid nok, mens den stadig effektiv i dissociering murine væv ved maternel-føtal grænseflade, og kræver ikke tilsætning af andre dissocierende reagenser eller serum Dissociation at afslutte reaktionen. Desuden er det klar til brug som leveret, og selv tidspunktet for dissociation skal valideres, er det mere robust end de ovenfor anførte enzymer 40,41.
Udnyttelsen af en kombination af begge typer af væv opdeling forbedrer kvaliteten og mængden af celler opnået; dermed har flere undersøgelser gennemført den kombinerede anvendelse af mekanisk og enzymatisk dissociation med tilfredsstillende resultat 31,32,37. Den her beskrevne protokol blev etableret og valideret i vores laboratorium; det bruger en kombination af en forsigtig mekanisk dissociation efterfulgt af et robust enzymatisk opdeling. Denne protokol tillader isoleringen og yderligere undersøgelse afde infiltrerende leukocytter i murine væv ved maternel-føtal grænseflade (livmoder, decidua og placenta). Følgende protokol opretholder også integriteten af celleoverflademarkører og udbytter nok levedygtige celler til efterfølgende anvendelser som påvist ved flowcytometrisk analyse. Endelig er denne protokol bevarer sammenhængen i forberedelse celle til analyse og sammenligning af forskellige murine væv der udgør maternel-føtal interface.
Indsamlingen af sammenhængende data, der registrerer overflod og fænotypiske karakteristika infiltrerende leukocytter ved maternel-føtal interface er afgørende for at forstå patogenesen af graviditetsrelaterede komplikationer. Adskillige teknikker er blevet beskrevet som letter isoleringen af infiltrerende leukocytter fra de murine væv på maternel-føtal grænseflade hele graviditeten 31,38,39,43-46. Men hver teknik er forskellige, anvender forskellige enzymer eller enzymkombinationer, kræ…
The authors have nothing to disclose.
NGL blev støttet af Wayne State University Perinatal Initiative i Maternal, Perinatal og børns sundhed. Vi takker Maureen McGerty og Amy E. Furcron (Wayne State University) for deres kritisk læsning af manuskriptet.
Magentic Cell Separation | |||
MS Columns | |||
Cell Separator | |||
30μm pre separation filters | |||
Multistand | |||
15mL safe lock conical tubes | |||
MACS Buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
Reagents | |||
Anti-mouse CD16/CD32 | |||
Anti-mouse extracellular antibodies | (Table 1) | ||
Sodium azide | |||
Bovine serum albumin | (BSA) | ||
LIVE/DEAD viability dye | |||
Fixation buffer solution | |||
FACS Buffer | (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2) | ||
Trypan Blue Solution 0.4% | |||
Fetal bovine serum | |||
Additional Instruments | |||
Incubator with shaker | |||
Flow cytometer | |||
Centrifuge | |||
Vacuum system | |||
Incubator | |||
Water bath | |||
Cell counter | |||
Microscope |