Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.
गर्भावस्था में प्रतिरक्षा सहिष्णुता माँ की प्रतिरक्षा प्रणाली को विकसित भ्रूण को स्वीकार करने और पोषण करने के क्रम में विशिष्ट परिवर्तन की प्रक्रिया की आवश्यकता है। यह सहिष्णुता, सहवास के दौरान शुरू की गर्भाधान और आरोपण के दौरान स्थापित किया गया है, और गर्भावस्था के दौरान बनाए रखा है। मातृ-भ्रूण सहिष्णुता की सक्रिय सेलुलर और आणविक मध्यस्थों नाल और गर्भाशय और decidual ऊतकों भी शामिल है जो मातृ-भ्रूण इंटरफेस है, के रूप में जाना भ्रूण और मातृ ऊतकों के बीच संपर्क के स्थल पर समृद्ध कर रहे हैं। इस इंटरफ़ेस stromal कोशिकाओं और घुसपैठ leukocytes के शामिल है, और उनके बहुतायत और प्ररूपी विशेषताओं गर्भावस्था के दौरान अधिक से बदल जाते हैं। मातृ-भ्रूण इंटरफेस में घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स एक साथ गर्भावस्था को बनाए कि स्थानीय माइक्रो माहौल बनाने कि न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, एन.के. कोशिकाओं, और NKT कोशिकाओं में शामिल हैं। इन कोशिकाओं को या किसी भी inapprop के बीच एक असंतुलनउनके phenotypes में riate परिवर्तन गर्भावस्था में इस रोग का एक तंत्र माना जाता है। इसलिए, मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस घुसपैठ कि leukocytes के अध्ययन गर्भावस्था संबंधी जटिलताओं को जन्म दे कि प्रतिरक्षा तंत्र को स्पष्ट करने के क्रम में आवश्यक है। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटियोलिटिक और मातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों से घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स अलग करने के लिए collagenolytic एंजाइमी कॉकटेल के साथ एक मजबूत एंजाइमी disaggregation द्वारा पीछा कोमल यांत्रिक हदबंदी का एक संयोजन का उपयोग करता है कि एक प्रोटोकॉल है। इस प्रोटोकॉल पर्याप्त संरक्षित प्रतिजनी और कार्यात्मक गुणों के साथ व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स (> 70%) की उच्च संख्या के अलगाव के लिए अनुमति देता है। पृथक ल्यूकोसाइट्स तो immunophenotyping, सेल छँटाई, इमेजिंग, immunoblotting, mRNA अभिव्यक्ति, सेल संस्कृति, और इस तरह के मिश्रित ल्युकोसैट प्रतिक्रियाओं, प्रसार, या cytotoxicity assays के रूप में इन विट्रो कार्यात्मक assays में सहित कई तकनीकों, द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है।
विशिष्ट परिवर्तन मां की प्रतिरक्षा प्रणाली के भीतर होते हैं जब गर्भावस्था में प्रतिरक्षा सहिष्णुता एक अवधि है। ये परिवर्तन मां भ्रूण, एक अर्द्ध allogenic भ्रष्टाचार 1 को सहन करने की अनुमति देते हैं। भ्रूण पैतृक प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (MHC) 2 एंटीजन, और भ्रूण कोशिकाओं मातृ परिसंचरण 3 में पाया गया है व्यक्त करता है; हालांकि, भ्रूण 4,5 अस्वीकार नहीं है। इस पहेली को पूरी तरह से समझ नहीं है।
सबसे हाल ही में परिकल्पना मातृ-भ्रूण सहिष्णुता सहवास के दौरान बनाया और 6,7 गर्भाधान और एक पूर्ण अवधि गर्भावस्था 8-10 बनाए रखने के लिए बनाए रखा है जो बताता है। इस मातृ-भ्रूण सहिष्णुता के टूटने गर्भावस्था 10-16 की जल्दी और देर चरणों के दौरान इस बीमारी का एक तंत्र माना जाता है। मातृ-भ्रूण सहिष्णुता टी कोशिकाओं (विनियामक टी कोशिकाओं, Th1 कोशिकाओं, Th2 कोशिकाओं, और Th17 कोशिकाओं), मैक सहित विभिन्न ल्युकोसैट उप आबादी की भागीदारी शामिलrophages, न्यूट्रोफिल, मस्तूल कोशिकाओं, एन.के. कोशिकाओं, और NKT कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं, और बी कोशिकाओं, गर्भावस्था 15,17-19 भर घनत्व और स्थानीयकरण में है कि परिवर्तन। मां की प्रतिरक्षा प्रणाली को भ्रूण एंटीजन 20,21 के साथ सूचना का आदान प्रदान, जहां शारीरिक साइट – मातृ-भ्रूण सहिष्णुता मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस 20 में समृद्ध है।
भ्रूण extravillous ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं गर्भाशय म्यूकोसा 22-24 आक्रमण जब मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस गर्भनाल के दौरान बनाई गई है। इस इंटरफेस का भ्रूण तरफ, भ्रूण झिल्ली नाल के भीतर एक विशेष उपकला सतह बनाने के लिए, और syncytiotrophoblast कोशिकाओं मातृ रक्त 22 के साथ अपने सीधे संपर्क के माध्यम से पोषक तत्व विदेशी मुद्रा नियंत्रण। इंटरफ़ेस की मातृ पक्ष पर, पत्या चूहों में सभी decidual कोशिकाओं के 50% से 30% के लिए खाते है कि leukocytes के एक विषम पूल भर्ती करता है। Matern में उनकी भागीदारी के अलावाअल प्रतिरक्षा सहिष्णुता, इन कोशिकाओं को गर्भावस्था के दौरान विभिन्न प्रक्रियाओं, उदा।, संक्रमण, गर्भाधान से प्रजनन पथ के संरक्षण, भ्रूण आरोपण 7,25, decidual एंजियोजिनेसिस 26, संवहनी remodeling के 24,27, ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण 28, अपरा के लिए महत्वपूर्ण योगदान कर रहे हैं विकास 24,25, और, अंततः, श्रम और प्रसव 15,17। इसलिए, मातृ-भ्रूण सहिष्णुता में शामिल leukocytes के अध्ययन गर्भावस्था संबंधी जटिलताओं के रोगजनन elucidating के लिए आवश्यक है।
Immunohistochemistry और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के उपयोग के प्रत्यक्ष दृश्य और गर्भाशय, decidual, या अपरा ल्यूकोसाइट्स 29,30 के स्थानीयकरण के लिए डेटा उत्पन्न किया है, वहीं आगे इन ऊतकों 31,32 में से प्रत्येक में leukocytes के विशिष्ट सबसेट से पता चला है प्रवाह cytometry विश्लेषण। इसके अतिरिक्त, cytometry के घनत्व और विद्यालय के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रवाहएनएएल-भ्रूण इंटरफ़ेस बाह्य और intracellular प्रोटीन 8-10,34 के 33 और अभिव्यक्ति के स्तर leukocytes। मातृ-भ्रूण इंटरफेस में leukocytes के cytometric विश्लेषण प्रवाह एक एकल कोशिका निलंबन की आवश्यकता है। Decidual, गर्भाशय, और अपरा ऊतकों से घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए, ऊतक हदबंदी के दो तरीकों का इस्तेमाल किया जा रहा है: यांत्रिक और enzymatic। दोनों ही तरीकों से इन ऊतकों की बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से घुसपैठ leukocytes की जुदाई अनुमति देते हैं। यह कम कतरनी बल-जुड़े नुकसान 35 के साथ leukocytes के एक उच्च उपज की अनुमति देता है के रूप में एंजाइमी ऊतक हदबंदी यांत्रिक ऊतक हदबंदी के लिए बेहतर है। नतीजतन, यांत्रिक ऊतक हदबंदी नमूनों की परिवर्तनशीलता और विविधता में वृद्धि हो सकती है, जो ऊतकों 36, पूलिंग की आवश्यकता है। फिर भी, यांत्रिक हदबंदी ब्याज की प्रतिजन एंजाइमी हदबंदी या जब तक बदला जा सकता है जब विकल्प हो सकता है सेल की कार्यक्षमताब्याज की जरूरत के संरक्षित किया जाना है (उदाहरण के लिए।, एन.के. कोशिकाओं की cytotoxicity) 35।
ईसीएम नीचा करने के लिए विशिष्ट एंजाइमों के साथ प्रोटियोलिसिस का उपयोग यांत्रिक हदबंदी के साथ मनाया कम पैदावार समाप्त। कई अध्ययनों से ट्रिप्सिन 32, collagenase 37, DNase 31, 38 dispase, और विभिन्न एंजाइमों 32,39 के वाणिज्यिक कॉकटेल के उपयोग की सूचना दी है। हालांकि, प्रकृति और विभिन्न एंजाइमों की एकाग्रता और पाचन की अवधि को सावधानी से परिभाषित किया है और immunophenotyping के लिए आवश्यक कोशिका की सतह प्रतिजनी epitopes की अखंडता के रखरखाव सुनिश्चित करने के क्रम में मान्य किया जाना चाहिए। विभिन्न सतह संरचनाओं कई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त ल्युकोसैट सतह epitopes अलग करना के लिए कुख्यात जा रहा है, इस तरह के ट्रिप्सिन के रूप में कुछ एंजाइमों के साथ, विभिन्न एंजाइमों द्वारा विनाश करने के लिए विभिन्न अतिसंवेदनशील होते हैं।
इस के साथ साथ शुरू की proteolyt का उपयोग कर एक विधि हैAccutase बुलाया आईसी और collagenolytic एंजाइमी कॉकटेल,। इस एंजाइमी समाधान पर्याप्त मातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों dissociating में है जबकि अभी भी कुशल विनम्र होता है, और हदबंदी प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए अन्य dissociating अभिकर्मकों या सीरम के अलावा आवश्यकता नहीं है। हदबंदी के समय मान्य किया जा करने की जरूरत है, हालांकि इसके अलावा, यह उसके ऊपर-विख्यात एंजाइमों 40,41 से अधिक मजबूत है, आपूर्ति के रूप में उपयोग करने के लिए तैयार है और।
ऊतक disaggregation के दोनों प्रकार का एक संयोजन का उपयोग प्राप्त कोशिकाओं की गुणवत्ता और मात्रा को सुधार; इस प्रकार, कई अध्ययनों से संतोषजनक परिणाम 31,32,37 के साथ यांत्रिक और enzymatic हदबंदी के संयुक्त उपयोग को लागू किया है। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल की स्थापना की और हमारी प्रयोगशाला में मान्य किया गया था; यह एक मजबूत एंजाइमी disaggregation के बाद कोमल यांत्रिक हदबंदी का एक संयोजन का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल के अलगाव और आगे के अध्ययन के लिए अनुमति देता हैमातृ-भ्रूण इंटरफेस में murine ऊतकों में घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स (गर्भाशय, पत्या, और प्लेसेंटा)। प्रवाह cytometric विश्लेषण के द्वारा प्रदर्शन के रूप में निम्नलिखित प्रोटोकॉल भी कोशिका की सतह मार्करों और बहाव के अनुप्रयोगों के लिए पैदावार काफी व्यवहार्य कोशिकाओं की अखंडता को बनाए रखता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल विश्लेषण और मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस रचना अलग murine ऊतकों की तुलना के लिए सेल तैयार की निरंतरता को बनाए रखता है।
मातृ-भ्रूण इंटरफेस में घुसपैठ leukocytes की बहुतायत और प्ररूपी विशेषताओं है कि रिकॉर्ड संगत डेटा के संग्रह गर्भावस्था संबंधी जटिलताओं के रोगजनन को समझने के लिए आवश्यक है। कई तकनीकों गर्भावस्था 31,38,39,43-46 भ?…
The authors have nothing to disclose.
एनजीएल मातृ, प्रसवकालीन और बाल स्वास्थ्य में वेन स्टेट यूनिवर्सिटी प्रसवकालीन इनीशिएटिव द्वारा समर्थित किया गया। हम कृतज्ञता पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए मॉरीन McGerty और एमी ई Furcron (वेन स्टेट यूनिवर्सिटी) स्वीकार करते हैं।
Magentic Cell Separation | |||
MS Columns | |||
Cell Separator | |||
30μm pre separation filters | |||
Multistand | |||
15mL safe lock conical tubes | |||
MACS Buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
Reagents | |||
Anti-mouse CD16/CD32 | |||
Anti-mouse extracellular antibodies | (Table 1) | ||
Sodium azide | |||
Bovine serum albumin | (BSA) | ||
LIVE/DEAD viability dye | |||
Fixation buffer solution | |||
FACS Buffer | (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2) | ||
Trypan Blue Solution 0.4% | |||
Fetal bovine serum | |||
Additional Instruments | |||
Incubator with shaker | |||
Flow cytometer | |||
Centrifuge | |||
Vacuum system | |||
Incubator | |||
Water bath | |||
Cell counter | |||
Microscope |