L'isolamento dei leucociti di tessuti murini all'interfaccia materno-fetale

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

Tolleranza immunitaria in gravidanza richiede che il sistema immunitario della madre subisce cambiamenti distintivi, al fine di accogliere e nutrire il feto in via di sviluppo. Questa tolleranza è iniziata durante il coito, stabilito durante la fecondazione e l'impianto, e mantenuto per tutta la gravidanza. Mediatori attivi cellulari e molecolari della tolleranza materno-fetale sono arricchiti nel sito di contatto tra tessuti fetali e materni, noto come l'interfaccia materno-fetale, che comprende la placenta e l'utero e tessuti deciduali. Questa interfaccia è costituito da cellule stromali e leucociti infiltranti, e le loro caratteristiche fenotipiche abbondanza e cambiano nel corso della gravidanza. Leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale includono neutrofili, macrofagi, cellule dendritiche, mastociti, le cellule T, cellule B, le cellule NK e cellule NKT che creano insieme il micro-ambiente locale che sostiene la gravidanza. Uno squilibrio tra queste cellule o qualsiasi inappropalterazione riate nei loro fenotipo è considerato un meccanismo di malattia in gravidanza. Pertanto, lo studio di leucociti che si infiltrano l'interfaccia materno-fetale è essenziale al fine di chiarire i meccanismi immunitari che portano a complicazioni legate alla gravidanza. Qui descritto è un protocollo che utilizza una combinazione di dissociazione meccanica delicata seguita da una disaggregazione enzimatica robusta con proteolitica e cocktail enzimatica collagenolitica isolare i leucociti infiltranti dai tessuti murini all'interfaccia materno-fetale. Questo protocollo consente l'isolamento di un alto numero di leucociti vitali (> 70%) con sufficientemente conservati proprietà antigeniche e funzionali. Isolati leucociti possono poi essere analizzati da diverse tecniche, tra cui immunofenotipizzazione, separazione delle cellule, l'imaging, immunoblotting, espressione di mRNA, coltura cellulare, e in vitro saggi funzionali quali reazioni contrastanti leucociti, la proliferazione, o saggi di citotossicità.

Introduction

Tolleranza immunitaria in gravidanza è un periodo in cui i cambiamenti caratteristici si verificano all'interno del sistema immunitario della madre. Queste modifiche permettono alla madre di tollerare il feto, un innesto semi-allogenico ^1. Il feto esprime paterna complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) ^2, e le cellule fetali sono stati trovati nel sangue materno ^3; tuttavia, il feto non è respinta ^4,5. Questo enigma non è pienamente compresa.

L'ipotesi più recente afferma che la tolleranza materno-fetale è creato durante il coito e la fecondazione ^6,7 e mantenuto per sostenere una gravidanza a termine ^8-10. La composizione della tolleranza materno-fetale è considerata un meccanismo di malattia durante i primi e ultime fasi della gravidanza, ^10-16. Tolleranza materno-fetale prevede la partecipazione di varie sottopopolazioni di leucociti, comprese le cellule T (cellule T regolatorie, cellule Th1, Th2 e cellule Th17), macrophages, neutrofili, mastociti, cellule NK, e cellule NKT, cellule dendritiche e le cellule B, che il cambiamento nella densità e localizzazione per tutta la gravidanza ^15,17-19. Tolleranza materno-fetale è arricchito all'interfaccia materno-fetale ²⁰ – sede anatomica in cui il sistema immunitario della madre interagisce con gli antigeni fetali ^20,21.

L'interfaccia materno-fetale viene creato durante placenta quando le cellule del trofoblasto extravilloso fetali invadono la mucosa uterina ^22-24. Sul lato fetale di questa interfaccia, le membrane che circondano il feto creano una superficie epiteliale specializzata all'interno della placenta e le cellule syncytiotrophoblast controllano lo scambio di nutrienti attraverso il contatto diretto con il sangue materno ^22. Sul lato materno dell'interfaccia, la decidua recluta un pool eterogeneo di leucociti che nei topi rappresentano il 30% al 50% di tutte le cellule deciduali. Oltre alla loro partecipazione a MaternAl tolleranza immunitaria, queste cellule sono fattori chiave per diversi processi durante la gravidanza, per esempio., la protezione del tratto riproduttivo dalle infezioni, la fecondazione, l'impianto dell'embrione ^7,25, decidual angiogenesi ^26, rimodellamento vascolare ^24,27, trofoblasto invasione ^28, placentare Sviluppo ^24,25, e, in ultima analisi, il lavoro e la consegna ^15,17. Pertanto, lo studio dei leucociti coinvolti nella tolleranza materno-fetale è essenziale per chiarire la patogenesi delle complicanze legate alla gravidanza.

Mentre l'uso di immunoistochimica e immunofluorescenza ha generato i dati per la visualizzazione diretta e la localizzazione di uterina, decidua, o leucociti placentari ^29,30, citofluorimetria analisi ha ulteriormente evidenziato specifici sottoinsiemi di leucociti in ciascuno di questi tessuti ^31,32. Inoltre, la citometria a flusso è stata utilizzata per determinare la densità e la proporzione di maternal-fetale interfaccia leucociti ³³ e di espressione livelli di proteine ​​extracellulari e intracellulari ^8-10,34. Analisi citofluorimetrica dei leucociti all'interfaccia materno-fetale richiede una cella singola sospensione. Per isolare leucociti infiltranti dal decidua, uterino, e tessuti placentari, sono stati utilizzati due metodi di dissociazione tissutale: meccanica ed enzimatica. Entrambi i metodi consentono la separazione dei leucociti infiltrati dalla matrice extracellulare (ECM) di questi tessuti. Dissociazione enzimatica dei tessuti è superiore alla dissociazione dei tessuti meccanica in quanto consente una resa superiore di leucociti con danni meno shear-force-associati ^35. Di conseguenza, la dissociazione tessuto meccanico richiede pooling tessuti ^36, che possono aumentare la variabilità e l'eterogeneità dei campioni. Tuttavia, la dissociazione meccanica può essere la scelta quando l'antigene di interesse può essere modificato per dissociazione enzimatica o quando la funzionalità della cellas di necessità interessi da preservare (ad es., la citotossicità delle cellule NK) ^35.

L'uso di proteolisi con enzimi specifici per degradare la ECM elimina le basse rese osservati con la dissociazione meccanica. Diversi studi hanno riportato l'uso di tripsina ^32, collagenasi ^37, DNase ^31, dispasi ^38, e cocktail commerciali di vari enzimi ^32,39. Tuttavia, la natura e la concentrazione di diversi enzimi e la durata della digestione devono essere accuratamente definiti e convalidati, al fine di assicurare il mantenimento dell'integrità degli epitopi antigenici superficie cellulare necessari per immunofenotipizzazione. Le varie strutture superficiali sono differenzialmente sensibili alla distruzione da diversi enzimi, con alcuni enzimi, come la tripsina, essendo noto per strippaggio epitopi superficie leucociti riconosciuti da molti anticorpi monoclonali.

Introdotto nel presente documento è un metodo che utilizza un proteolytic e collagenolitica cocktail enzimatico, chiamato Accutase. Questa soluzione enzimatica è abbastanza delicato mentre ancora efficiente in dissociare tessuti murini all'interfaccia materno-fetale, e non richiede l'aggiunta di altri reagenti dissociazione o siero per terminare la reazione di dissociazione. Inoltre, è pronto per l'uso come fornito e, anche se il tempo di dissociazione deve essere convalidata, è più robusto rispetto ai sopra citati enzimi ^40,41.

L'utilizzo di una combinazione di entrambi i tipi di disaggregazione tessuto migliora la qualità e la quantità di cellule ottenute; in tal modo, diversi studi hanno implementato l'uso combinato di dissociazione meccanica ed enzimatica con risultati soddisfacenti ^31,32,37. Il protocollo qui descritto è stato fondato e validato nel nostro laboratorio; si utilizza una combinazione di una dissociazione meccanica delicata seguita da una disaggregazione enzimatica robusta. Questo protocollo permette lo studio ulteriore isolamento e dileucociti infiltranti in tessuti murini all'interfaccia materno-fetale (utero, decidua, e placenta). Il seguente protocollo mantiene anche l'integrità dei marcatori di superficie delle cellule e dei rendimenti cellule vitali sufficienti per applicazioni a valle come dimostrato dalle analisi di citometria di flusso. Infine, questo protocollo mantiene la consistenza della preparazione cellulare per l'analisi e il confronto dei diversi tessuti murini che compongono l'interfaccia materno-fetale.

Protocol

Prima di lavorare con i campioni di cui al presente protocollo, l'approvazione etica animale deve essere dato dal Research Comitato Etico Locale e la revisione Istituzionali Boards. Quando si lavora con sangue animale, cellule, o di agenti pericolosi, come indicato in questo protocollo, le azioni di biosicurezza e di sicurezza di laboratorio adeguate devono essere seguite. 1. Manipolazione Mouse e tessuto Collection Preparare una workstation sterile e ottenere strumenti steril…

Representative Results

La dissezione dei tessuti murini dall'interfaccia materno-fetale è mostrato in Figura 1; questa procedura prevede l'apertura della cavità peritoneale (Figura 1A, B), corna uterine (Figura 1C), compresi i siti di impianto (Figura 1D), e la raccolta di tessuti uterini (Figura 1E), la placenta (Figura 1F), e tessuti decidua (Figura 1G) a 16.5 dpc. La Figura 2 mostra la morfologia…

Discussion

La raccolta di dati coerenti che registra le caratteristiche fenotipiche e abbondanza di leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale è essenziale per comprendere la patogenesi delle complicanze legate alla gravidanza. Sono state descritte diverse tecniche che facilitano l'isolamento di leucociti infiltranti dai tessuti murini all'interfaccia materno-fetale durante la gravidanza ^{31,38,39,43-46.} Tuttavia, ogni tecnica è differente, utilizza enzimi o combinazioni di enzimi diversi, richied…

Materials

			Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies			(Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin			(BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer			(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
			Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope