Выделение лейкоцитов из мышиного тканей на матери и плода интерфейс

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

Иммунная толерантность во время беременности требует, чтобы иммунная система матери претерпевает изменения отличительные для того, чтобы принимать и лелеять развивающегося плода. Эта терпимость начинается при половом акте, созданы во оплодотворения и имплантации, и поддерживается на протяжении всей беременности. Активные клеточные и молекулярные медиаторы толерантности материнской плода обогащены в месте контакта между плода и материнской тканей, известных как материнской плода интерфейс, который включает в себя плаценту и матки и децидуальной ткани. Этот интерфейс состоит из стромальных клеток и инфильтрацией лейкоцитов, и их обилие и фенотипические характеристики меняются в течение беременности. Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода включают нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки, тучные клетки, Т-клетки, В-клетки, NK-клетки и NKT клетки, которые вместе создают локальную микросреду, которая поддерживает беременность. Дисбаланс между этими клетками или любой inappropетел изменение в их фенотипов считается механизм болезни во время беременности. Таким образом, исследование лейкоцитов, которые проникают интерфейс материнской плода необходимо для того, чтобы выяснить иммунных механизмов, которые приводят к осложнениям, связанных с беременностью. Описанный здесь протокол, который использует комбинацию нежной механической диссоциации с последующим надежной ферментативной дезагрегации с протеолитической и коллагенолитического ферментативной коктейль, чтобы изолировать Лейкоциты проникают из мышиных тканей на границе материнской плода. Этот протокол позволяет изоляции высокой численности жизнеспособных лейкоцитов (> 70%) с достаточно консервативными антигенных и функциональные свойства. Изолированные лейкоциты могут быть проанализированы с помощью нескольких методов, в том числе иммунофенотипирования, сортировки клеток, изображений, иммуноблотинга, экспрессии мРНК, клеточной культуры, и в пробирке функциональных анализов, таких как смешанные реакции лейкоцитов, пролиферации, или цитотоксичности.

Introduction

Иммунная толерантность во время беременности период, когда отличительные изменения происходят в иммунной системе матери. Эти изменения позволяют мать терпеть плод, полу-аллогенную трансплантата ^1. Плод выражает отцовской главного комплекса гистосовместимости (МНС) антигены ² и фетальные клетки были обнаружены в материнском кровотоке ^3; Однако, плод не отторгается ^4,5. Это загадка полностью не поняты.

Самая недавняя гипотеза утверждает, что толерантность материнского плода создается во время полового акта и оплодотворения ^6,7 и поддерживается выдержать полный срок беременности ^8-10. Разбивка этой материнской плода толерантности считается механизм заболевания на ранних и поздних стадиях беременности ^10-16. Допуск матери и плода включает в себя участие различных лейкоцитов групп населения, в том числе Т-клеток (регуляторных Т-клеток, клеток Th1, Th2 клеток, и клетки Th17), Macмакрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, NK-клетки, и НКТ-клеток, дендритные клетки, В-клетки и, что изменения в плотности и локализации во время беременности ^15,17-19. Допуск матери и плода обогащается на материнской плода интерфейс ²⁰ – анатомической месте, где иммунная система матери взаимодействует с антигенами плода ^20,21.

Интерфейс материнской плода создается во время плаценты, когда эмбриональные клетки трофобласта extravillous вторгнуться слизистой оболочки матки ^22-24. На стороне плода этого интерфейса, мембраны, окружающие плод создать специализированный эпителиальной поверхности в плаценте, и syncytiotrophoblast клетки контролировать обмен питательных веществ через их непосредственном контакте с материнской кровью ^22. По материнской стороне интерфейса, децидуальной набирает гетерогенную пул лейкоцитов у мышей, которые составляют 30% до 50% всех клеток плаценты. В дополнение к их участию в Матерналь иммунной толерантности, эти клетки являются главными участниками различных процессов во время беременности., например, защиты репродуктивного тракта от инфекций, оплодотворения, имплантации эмбриона ^7,25, децидуальный ангиогенез ^26, ремоделирование сосудов ^24,27, трофобласт вторжение ^28, плацентарный Развитие ^24,25, и, в итоге, труда и доставка ^15,17. Таким образом, изучение лейкоцитов, участвующих в толерантности материнской плода имеет важное значение для выяснения патогенеза осложнений, связанных с беременностью.

Хотя использование иммуногистохимии и иммунофлуоресценции породила данные для непосредственной визуализации и локализации матки, плаценты, или плацентарных лейкоцитов ^29,30, проточной цитометрии анализа показали еще более конкретные субтипов лейкоцитов в каждой из этих тканей ^31,32. Кроме того, проточной цитометрии был использован для определения плотности и часть оболочкинал плода интерфейс лейкоциты ³³ и уровни экспрессии внеклеточных и внутриклеточных белков ^8-10,34. Проточной цитометрии анализ лейкоцитов на границе материнской плода требует одного суспензии клеток. Для того, чтобы изолировать Лейкоциты проникают из децидуальной, матки, плаценты и тканей, были использованы два метода ткани диссоциации: механическая и ферментативная. Оба метода позволяют разделение проникших лейкоцитов из внеклеточного матрикса (ЕСМ) этих тканей. Ферментативный диссоциации ткани превосходит механической ткани диссоциации, так как позволяет более высокий выход лейкоцитов с менее сдвига силы ассоциированного повреждения ^35. Следовательно, механическая ткани диссоциации требует объединения тканей ^36, которые могут увеличить изменчивость и неоднородность образцов. Тем не менее, механической диссоциации может быть выбор, когда представляющий интерес антиген может быть изменена путем ферментативной диссоциации или, когда функциональные клеткис процентной необходимости быть сохранены (например., цитотоксичность NK клеток) ^35.

Использование протеолиза с конкретными ферментами, чтобы ухудшить ECM исключает низкие выходы, наблюдаемые с механической диссоциацией. Некоторые исследования показали использование трипсина ^{32, 37,} коллагеназы ДНКазы ³¹ диспазу ³⁸ и коммерческих коктейлей различных ферментов ^32,39. Однако природа и концентрация различных ферментов и продолжительность пищеварения должны быть тщательно определена и подтверждена, чтобы гарантировать поддержание целостности клеточных поверхностных антигенных эпитопов, необходимых для иммунофенотипирования. Различные структуры поверхности дифференциально восприимчивы к разрушению различными ферментами, с некоторыми ферментами, такими как трипсин, будучи известно, для зачистки поверхности лейкоцитов эпитопы, распознаваемые многих моноклональных антител.

Введенный здесь, представляет собой способ, использующий proteolytIC и коллагенолитической ферментативная коктейль, названный Accutase. Это решение ферментативного нежно достаточно в то же время эффективно диссоциации мышиных тканей на границе материнской плода, и не требует добавления других реагентов или диссоциирующих сыворотки, чтобы закончить реакцию диссоциации. Кроме того, он готов для использования в качестве подается и, хотя время диссоциации должно быть подтверждено, что более надежными, чем вышеуказанных ферментов ^40,41.

Использование комбинации обоих типов тканей дезагрегации улучшает качество и количество клеток, полученных; Таким образом, несколько исследований реализованы комбинированное применение механической и ферментативной диссоциации с удовлетворительными результатами ^31,32,37. Протокол, описанный здесь, был создан и утверждена в нашей лаборатории; он использует комбинацию мягкого механического диссоциации с последующим надежной ферментативной дезагрегации. Этот протокол позволяет изоляции и дальнейшее изучениев проникают лейкоциты в мышиных тканях на границе материнской плода (матка, децидуальной и плацента). Следующий протокол также поддерживает целостность маркеров клеточной поверхности и доходности достаточно жизнеспособных клеток для последующих применений, как показано с помощью анализа проточной цитометрии. Наконец, этот протокол поддерживает согласованность клеточного препарата для анализа и сравнения различных мышиных тканях, составляющих интерфейс материнской плода.

Protocol

Перед началом работы с образцами, указанных в этом протоколе, животное этическое одобрение должно быть дано комитетом по этике местного научно-исследовательского и организационного обзора советов по. При работе с кровью животных, клетки, или опасных веществ, упомянутые в настоящем пр?…

Representative Results

Рассечение тканей мышиных из интерфейса материнской плода показано на рисунке 1; эта процедура включает в себя открытие в брюшную полость (рис 1а, б), рога матки (рис 1в) в том числе мест имплантации (рис 1D) и сбор маточных тканей (рис 1E), плацент?…

Discussion

Коллекция согласованных данных, которая записывает обилие и фенотипические характеристики Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода имеет важное значение для понимания патогенеза осложнений, связанных с беременностью. Несколько методов было описано, что облегчать отделен…

Materials

			Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies			(Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin			(BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer			(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
			Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope