إنشاء وتوصيف UTI وCAUTI في نموذج الفأر

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

التهابات المسالك البولية (UTI) واسعة الانتشار، وهو سبب مهم للمراضة وتزداد مقاومة للعلاج بالمضادات الحيوية. تعاني النساء بشكل غير متناسب UTI: سوف 50٪ من جميع النساء لديهم التهاب المسالك البولية في حياتهم. بالإضافة إلى ذلك، 20-40٪ من هؤلاء النساء الذين لديهم وعلى UTI الأولي تعاني من تكرار مع بعض الذين يعانون تكرار المتكررة مع تدهور خطير في نوعية الحياة والألم وعدم الراحة، وتعطل الأنشطة اليومية، وزيادة تكاليف الرعاية الصحية، وقلة الخيارات العلاجية الأخرى من العلاج الوقائي بالمضادات الحيوية على المدى الطويل. Uropathogenic الإشريكية القولونية (UPEC) هو المسبب الرئيسي للمجتمع المكتسبة UTI. المرتبطة القسطرة UTI (CAUTI) هو الأكثر شيوعا المستشفى العدوى المكتسبة المحاسبة للحصول على مليون الحوادث في الولايات المتحدة سنويا، وتكاليف الرعاية الصحية الهائلة. في حين UPEC هو أيضا السبب الرئيسي لCAUTI، العوامل المسببة الآخرين من أهمية متزايدة بما في ذلك المعويةالبرازية. نحن هنا استخدام نموذجين الماوس راسخة أن ألخص العديد من الخصائص السريرية لهذه الأمراض التي تصيب الإنسان. لUTI، وهذا نموذج C3H / الدجاجة يلخص العديد من الميزات من UPEC الفوعة لوحظ في البشر بما في ذلك ردود المضيفة، وتشكيل IBC وfilamentation. لCAUTI، وهذا نموذج باستخدام C57BL / 6 الفئران، التي تحتفظ زرع المثانة قسطرة، وقد تبين أن تكون عرضة للE. البرازية عدوى المثانة. وتستخدم هذه النماذج التمثيلية للحصول على أفكار جديدة لفتا إلى التسبب في مرض التهاب المسالك البولية، مما يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة واستراتيجيات إدارة أو منع.

Introduction

التهابات المسالك البولية (عدوى المسالك البولية) هي واحدة من الالتهابات البكتيرية الأكثر شيوعا ويمكن تقسيمها إلى فئتين استنادا إلى آلية الاستحواذ والمجتمع والمكتسبة بالمستشفيات المكتسبة UTI. وقد أظهرت عدوى المسالك البولية غالبا ما تحدث في النساء والدراسات الأصحاء المكتسبة من المجتمع وأن ما يقرب من 50٪ من النساء واحد على الأقل UTI في حياتهم ^1. بالإضافة إلى ذلك، تكرار مشكلة كبيرة. وقالت امرأة لديها العدوى الحادة الأولي لديه فرصة 25-40٪ من وجود عدوى الثانية في غضون ستة أشهر رغم ذلك مناسبا العلاج بالمضادات الحيوية والعديد من النساء ما زلن أن يكون تكرار متكررة ^2. البكتيريا التي تسبب هذه الالتهابات أصبحت أيضا المضادات الحيوية على نحو متزايد مقاومة المزيد من بروتوكولات العلاج التباس ^3-6. UTI تؤثر على ملايين الأشخاص في كل عام تكلف ما يقرب من 2.5 مليار دولار في النفقات المتعلقة بالرعاية الصحية في الولايات المتحدة، مما يؤكد تأثير وانتشار المرضاكتسبت 1،7 .Nosocomial عدوى المسالك البولية ترتبط أساسا مع وجود أجسام غريبة مثل القسطرة سكنى. المرتبطة القسطرة البولية (CAUTI) تبقى المكتسبة بالمستشفيات الأكثر شيوعا المكتسبة UTI، وهو ما يمثل ~ 70-80٪ من هذه الإصابات ^8. وعلاوة على ذلك، يرتبط CAUTI مع زيادة معدلات الاعتلال والوفيات وهذا هو السبب الأكثر شيوعا للالتهابات مجرى الدم الثانوية ^9.

ويعتقد UPEC المجتمع المرتبطة المكتسبة عدوى المسالك البولية أن يكون ناجما عن إدخال البكتيريا إلى المثانة من الخزانات في الجهاز الهضمي عن طريق التلاعب الميكانيكية أثناء الجماع الجنسي، وسوء النظافة أو غيرها من ديناميات السكان الميكروبية بين مضيف آخر الكوات ^10. مرة واحدة داخل المثانة، UPEC توظيف العديد من عوامل الفوعة، بما في ذلك كبسولة، ونظم الحصول على الحديد، والسموم، البلازميد الفوعة، tRNAs والجزر المرضية وعوامل الاستعمار التي ثبت أنها تلعب دورا في التسبب <سوب> 11-14. حاسمة لإنشاء UPEC الاستعمار، UPEC أيضا ترميز أنواع متعددة من كوصي اللصق فاتحة الطريق (CUP) الشعرة التي تعترف مستقبلات مع خصوصية الفراغية ^15. نوع 1 الشعرة، يميل مع adhesin FimH، يتم التعبير من قبل UPEC وربط uroplakins ¹⁶ و α-1، β-3 integrins ^17، والتي يتم التعبير عنها على سطح اللمعية كل قربة الإنسان والفأر ¹⁸ mannosylated. هذه التفاعلات بوساطة FimH تسهل الاستعمار الجرثومي وغزو الخلايا الظهارية السطحية ^19،20. مرة واحدة داخل الخلية، يمكن UPEC الهروب إلى السيتوبلازم حيث بكتيريا واحدة يمكن تقسيم بسرعة لتشكيل المجتمع البكتيريا داخل الخلايا (IBC)، التي تقوم عليها النضج، يمكن أن تحتوي على البكتيريا ~ 10 ^{4 21.} وقد تجلى تشكيل IBC في لا يقل عن ستة سلالات مختلفة الماوس، C3H / الدجاجة، C3H / HEJ، C57BL / 6، CBA، FVB / NJ وBALB / ج، ومع طائفة واسعة من مختلف تعميم التعليم الابتدائيسلالات C وغيرها المعوية ^22-24. لكن الاختلافات الزمنية والمكانية لتشكيل IBC يمكن أن تختلف تبعا لخلفية الماوس والضغط اصابة UPEC. في C3H / الفئران دجاجة مصابة UPEC تنميط سلالات UTI89 أو تشكيل CFT073، IBC يمكن تصور الكتل الحيوية كما صغيرة من البكتيريا في وقت مبكر من 3 HPI (عدوى آخر ساعة). استمر هذا المجتمع لتوسيع ويصل إلى "نقطة الوسط" للتنمية حوالي 6 HPI عندما تحتل قضيب على شكل بكتيريا نسبة كبيرة من مساحة هيولي من خلايا مظلة سطحية متباينة عضال هذه أوائل شكل الحاويات الوسيطة بطريقة متزامن نسبيا مع الأغلبية التي تظهر أبعاد مماثلة والأشكال التضاريسية. ~ 8 HPI البكتيريا في التغيير IBC من العصيات لمكورات التشكل. الحاويات الوسيطة هي عابرة في الطبيعة. وبالتالي، IBC النضج 12-18 النتائج HPI في التوسع المستمر للسكان البكتيريا، تليها filamentation وتشتيت للخروج من واي الخليةث انتشار لاحق إلى الخلايا المجاورة ^23. وبالتالي، فإن مكانة IBC يسمح لنمو البكتيريا السريع في بيئة محمية من المضيف الاستجابات المناعية والمضادات الحيوية ^25. ويلاحظ في مراحل متميزة من العدوى UPEC التي ينظر إليها في الفئران كما في البشر، مثل الحاويات الوسيطة وfilamentation، ودعم نموذج الفأر من UTI كأداة المفيدة التي يمكن استخدامها لنموذج UTI في البشر ^22،26-28.

في حين أن الغالبية العظمى من النساء يعانين من التهاب المسالك البولية في حياتهم، ونتيجة هذه الالتهابات يمكن أن تتراوح من الإصابة الذاتي الحد الحاد مع عدم وجود تكرار لالتهاب المثانة المتكرر بشكل متكرر. وعلاوة على ذلك، فقد أظهرت الدراسات حدوث عائلي قوي من التهاب المسالك البولية، مما يشير إلى يساهم عنصر وراثي للحساسية UTI ^29. لقد وجدنا أن نتائج UTI اختلاف ينظر في عيادات يمكن يتجلى في نتائج مختلفة من العدوى UPEC التجريبية بين السلالات الفطرية الماوس ^30. على سبيل المثال، C3H / الدجاجة، CBAوالفئران DBA، وC3H / HeOuJ عرضة، بطريقة تعتمد على الجرعة المعدية، ليدوم طويلا، التهاب المثانة المزمن يتميز المستمرة، والبكتيريا عيار عالية (> 10 ⁴ مستعمرة (كفو) / مل)، عيار عالية بكتيريا أعباء المثانة بتضحيات> 4 أسابيع بعد الإصابة (WPI)، والتهاب مزمن، ونخر الظهارة البولية. هذه الفئران أيضا عرض مستويات المصل مرتفعة من IL-6، G-CSF، KC، وIL-5 في HPI 24 الأولى التي تكون بمثابة المؤشرات الحيوية لتطوير التهاب المثانة المزمن. هذا قد يمثل بدقة المسار الطبيعي للUTI في بعض النساء، حيث أظهرت الدراسات همي أن نسبة كبيرة من النساء تعاني سوف UTI محافظة على مستويات عالية من البكتيريا في البول لعدة أسابيع بعد ظهور الأعراض الأولى من التهاب المثانة إذا لم تعط العلاج بالمضادات الحيوية ^{31 (32 عاما).} وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الفئران C3H / الدجاجة، وجدنا أن تاريخ من التهاب المثانة المزمن هو عامل خطر كبير للعدوى المتكررة الشديدة اللاحقة. المتكررة UTI هو الأكثر سيالمظاهر السريرية gnificant من التهاب المسالك البولية والماوس C3H / الدجاجة حاليا النموذج الوحيد الذي يلخص درس تهيء زادت بعد التعرض السابق. ولخص A نتائج UTI الثانية في C57BL / 6 الفئران حيث الإصابة UPEC الحاد محدودة ذاتيا، مع قرار من التهاب المثانة والجرثومية غضون ما يقرب من أسبوع. ومن المثير للاهتمام، في هذا النموذج، UPEC تشكيل بسهولة الخزانات داخل الخلايا هادئة داخل أنسجة المثانة التي UPEC قادرون على الخروج من حالة سبات على بدء لUTI نشط، ويحتمل أن تشرح آلية واحدة لنفس السلالة UTI المتكرر في البشر ^{33 و 34.}

بالإضافة إلى التأثيرات الوراثية على UTI الحساسية، وإدخال قسطرة في المثانة يزيد كثيرا من احتمال وجود العدوى، وكذلك زيادة نطاق من البكتيريا قادرة على أن تسبب عدوى. وقد ثبت أن القسطرة البولية الإنسان تسبب النسيجية والتغيرات المناعية في المثانة بسبب الإجهاد الميكانيكي الذي يؤدي إلى الاستجابة الالتهابية قوية، تقشير، وذمة من الصفيحة المخصوصة وsubmucusa، ترقق الظهارة البولية، والغشاء المخاطي آفة من الظهارة البولية والكلى ^35،36. بالإضافة إلى ذلك، توفر القسطرة سطح لالتصاق البكتيريا وبالتالي خلق بيئة التي تستخدمها العديد من الأنواع أن يسبب CAUTI. في حين UPEC لا تزال مساهما رئيسيا، وحسابات المعوية البرازية عن 15٪ من هذه CAUTI ^37. E. البرازية تزداد مقاومة للمضادات الحيوية مع فانكومايسين مقاومة ظهور، مما يشكل مشكلة صحية خطيرة ^38. E. البرازية تمتلك عوامل الفوعة عديدة من بينها السموم وadhesins اللازمة لمرفق لكل من القسطرة وظهارة ^38. خلال القسطرة البولية، والمضيف هو عرضة للميكروبات التصاق والضرب ونشر في المسالك البولية ^39،40. E. faecaالدعاوى تشكل الأغشية الحيوية على القسطرة كجزء من آلية لتستمر في المثانة وتنشر على الكلى، والذي يرد في الماوس CAUTI نموذج ^41. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أنه خلال القسطرة البولية، ويتم تحريرها الفيبرينوجين (FG) في المثانة كجزء من الاستجابة الالتهابية. FG يتراكم في المثانة، والمعاطف القسطرة، كما أنه ضروري لE. البرازية تشكيل بيوفيلم، يعمل بمثابة سقالة المرفق. في نموذج C57BL / 6 الماوس من CAUTI، اكتشفنا أن E. تشكيل بيوفيلم البرازية على القسطرة، وبالتالي استمرار في المثانة، وكان يعتمد على شعرة EBP، وتحديدا في EbpA طرف adhesin. وجدنا أن المجال N-محطة من EbpA يربط خصيصا لFG طلاء القسطرة. بالإضافة إلى ذلك، فقد وجد أن E. البرازية تستخدم FG كمصدر الأيض خلال العدوى، مما يعزز تشكيل بيوفيلم ^42.

وقد أثبتت نماذج الماوس حاسم لالفضوليةtanding وكذلك التنبؤ المظاهر السريرية للالتهاب المسالك البولية وCAUTI ^41. في هذه المقالة أن نبرهن إعداد اللقاح من التهاب المثانة UPEC عزل UTI89 والتلقيح عبر الاحليل من الفئران C3H / الدجاجة. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر بروتوكول لإدخال القسطرة في C57BL / 6 الفئران والتلقيح من E. البرازية OG1RF سلالة. كل من هذه الأساليب تؤدي إلى التهاب المسالك البولية ثابت وموثوق بها أو CAUTI في الفئران. نحن أيضا عرض التقنيات المستخدمة لمراقبة تشكيل IBC خلال التهاب المثانة الحاد وجمع البول لتحليل التهاب المثانة المزمن أو المتكرر. وقد استخدمت الفئران C3H / الدجاجة لدراسة جوانب UPEC المرضية بما في ذلك الغزو الأولي البكتيرية، وتشكيل IBC، filamentation وتطوير التهاب المثانة المزمن ^23،33،43. كما درست هذه المعايير الفوعة في مجموعة متنوعة من الخلفيات الماوس الأخرى ^22،33. لCAUTI، وC57BL / 6 النموذج يسمح لزرع جسم غريب في المثانة مع زملاء البكتيرية لاحقاlonization، والتي لا يمكن الحفاظ عليه لمدة 7 أيام بعد الإصابة ^41. كانت هذه نماذج مفيدة لتقييم آليات الفوعة البكتيرية، والاستجابات المضيفة لالتهاب المسالك البولية وآليات لتخريب الردود المضيف، والكثير منها تم تلخيصها في وقت لاحق أو التي لوحظت في البشر السريري.

Protocol

بيان الأخلاق: وافقت لجنة الدراسات الحيوان في جامعة واشنطن جميع الإصابات الماوس والإجراءات كجزء من البروتوكول رقم 20120216، الذي وافق 2013/1/11 وتنتهي 2016/01/11. وكانت الرعاية الشاملة للحيوانات بما يتفق مع دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المجلس الوطني للبحوث ودليل …

Representative Results

نماذج من داخل المثانة غير معقدة والقسطرة UTI المرتبطة توفر منصات مرنة لتوضيح الآليات الجزيئية المرضية البكتيرية، وتأثير هذه الأمراض على الأنسجة المضيف، وتطوير واختبار نهج جديدة لإدارة هذه العدوى المشتركة والمكلفة. اعتمادا على سلالة الماوس والممرض، التلقيح إينترفس?…

Discussion

اكتسب المجتمع غير معقدة UTI هو عدوى شائعة ومكلفة يمثل عدة ملايين من مرة الرعاية الصحية الأولية في كل عام ^46. بالإضافة إلى ذلك، CAUTIs هي العدوى المكتسبة الرعاية الصحية الشائعة التي أصبحت مكلفة لمقدمي الرعاية الصحية باعتبارها مراكز الرعاية الصحية والخدمات الطبية لل?…

Materials

Material for catheter and needle preparation:
30ga needles	BD Precision Glide	305106	30Gx ½ (0.3 mm x 13mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 mL
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs – Stainless Steel – Large Capacity –
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 in
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 in x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1X Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299