Création et caractérisation de l'UTI et Cauti dans un modèle de souris

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

Les infections des voies urinaires (IVU) sont très répandus, une cause importante de morbidité et sont plus résistantes aux traitements avec des antibiotiques. Les femmes sont beaucoup affligé par UTI: 50% de toutes les femmes auront une infection urinaire dans leur vie. En outre, 20-40% de ces femmes qui ont une première UTI subira une récidive avec certains souffrant de récidives fréquentes avec grave détérioration de la qualité de vie, la douleur et l'inconfort, la perturbation des activités quotidiennes, l'augmentation des coûts de soins de santé, et quelques options de traitement autres de prophylaxie antibiotique à long terme. Uropathogène Escherichia coli (UPEC) est l'agent causal primaire de la communauté acquise UTI. UTI du cathéter-associé (Cauti) est l'hôpital infection la plus fréquente acquis représente un million occurrences dans les États-Unis chaque année et les coûts de soins de santé dramatiques. Alors que UPEC est également la principale cause de Cauti, d'autres agents pathogènes sont d'une importance accrue, y compris Enterococcusfaecalis. Ici, nous utilisons deux modèles de souris bien établies qui récapitulent plusieurs des caractéristiques cliniques de ces maladies humaines. Pour UTI, un modèle C3H / HeN récapitule la plupart des caractéristiques de virulence UPEC observés chez les humains y compris les réponses de l'hôte, la formation IBC et filamentation. Pour Cauti, en utilisant un modèle souris C57BL / 6, qui conservent les implants cathéter de la vessie, a été montré pour être sensibles à E. faecalis infection de la vessie. Ces modèles représentatifs sont utilisés pour acquérir de nouvelles connaissances frappantes dans la pathogenèse de la maladie UTI, qui conduit à la mise au point de nouveaux traitements et stratégies de gestion ou de prévention.

Introduction

Infections des voies urinaires (IVU) sont l'une des infections bactériennes les plus courantes et peuvent être divisés en deux catégories basées sur le mécanisme d'acquisition, la communauté et nosocomiale acquise UTI. Les infections urinaires se produit souvent chez les femmes et des études, autrement sains acquis communautaire ont montré qu'environ 50% des femmes auront au moins une infection urinaire dans leur vie ^1. En outre, la récidive est un problème majeur. Une femme qui a une infection aiguë initiale a une chance d'avoir une seconde infection dans les six mois malgré un traitement antibiotique approprié et de nombreuses femmes continuent à avoir de fréquentes récidives ² 25-40%. Les bactéries qui causent ces infections sont également de plus en plus de protocoles de traitement de plus en plus résistantes aux antibiotiques de confusion ^3-6. UTI affectent des millions de personnes chaque année coûte environ 2,5 milliards de dollars en frais liés aux soins de santé aux États-Unis, soulignant l'impact et la prévalence de la maladie1,7 .Nosocomial acquis les infections urinaires sont principalement liés à la présence de corps étrangers tels que cathéters. les infections urinaires de cathéter associée (Cauti) restent la nosocomiale la plus fréquente acquise UTI, représentant ~ 70-80% de ces infections ^8. En outre, Cauti est associée à une augmentation de la morbidité et de la mortalité et il est la cause la plus fréquente des infections sanguines secondaires ^9.

Communauté associée UPEC acquis les infections urinaires sont pensés pour être causé par l'introduction de bactéries dans la vessie à partir de réservoirs dans le tractus gastro-intestinal par le biais d'une manipulation mécanique pendant les rapports sexuels, le manque d'hygiène ou d'autres dynamique des populations microbiennes entre l'hôte différentes niches ^10. Une fois à l'intérieur de la vessie, UPEC emploient de nombreux facteurs de virulence, y compris la capsule, les systèmes d'acquisition du fer, des toxines, un plasmide de virulence, ARNt, îlots de pathogénicité et de facteurs de colonisation qui ont été montrés à jouer un rôle dans la pathogenèse <sup> 11-14. Critique à l'établissement de la colonisation UPEC, UPEC codent également plusieurs types de chaperon adhésif huissier voie (CUP) pili qui reconnaissent les récepteurs avec une spécificité stéréochimique ^15. Pili de type 1, pointe avec l'adhésine FimH, sont exprimées par l'UPEC et lier uroplakins ¹⁶ et α-β-1, 3 intégrines ^17, qui sont exprimés sur la surface luminale des deux vessies humaines et de souris ¹⁸ mannosylée. Ces interactions à médiation FimH faciliter la colonisation bactérienne et l'invasion des cellules epitheliales superficielles ^19,20. Une fois à l'intérieur de la cellule, UPEC peut échapper dans le cytoplasme où une seule bactérie peut rapidement diviser pour former une communauté bactérienne intracellulaire (IBC), qui, lors de la maturation, peut contenir ~ 10 ^{4 21} bactéries. Formation IBC a été démontrée dans au moins six différentes souches de souris, C3H / poule, C3H / HeJ, C57BL / 6, ABC, FVB / NJ et BALB / c, et avec une grande variété de différentes UPESouches de carbone et d'autres Enterobacteriaceae ^22-24. Toutefois, des différences temporelles et spatiales de la formation IBC peuvent varier en fonction de l'arrière-plan de la souris et la souche UPEC infecter. Dans C3H / HeN infectées par le UPEC prototypique souches UTI89 ou la formation CFT073, IBC peuvent être visualisés sous forme de petites biomasses de bactéries dès 3 HPI (post-infection h). Cette communauté continue à se développer et atteint un "point médian" de développement d'environ 6 hpi lorsque les bactéries en forme de bâtonnets occupent un grand pourcentage de l'espace cytoplasmique de cellules parapluie superficielles différenciées Ces forme précoce GRV d'une manière relativement synchrone avec la majorité affichant des dimensions similaires et morphologies. ~ 8 hpi les bactéries dans le changement IBC d'une bacilles à Cocci morphologie. GRV sont de nature transitoire. Ainsi, le BAC maturation 12-18 résultats de HPI à l'expansion continue de la population bactérienne, suivi par leur filamentation et la dispersion de la wi cellulaireth propagation ultérieure à des cellules voisines ^23. Ainsi, le créneau IBC permet une croissance bactérienne rapide dans un environnement à l'abri de réponses ²⁵ immunitaires et des antibiotiques hôtes. Les étapes distinctes d'infection UPEC qui sont vus dans les souris sont également observées chez l'homme, tels que les GRV et filamentation, soutenant le modèle de la souris de l'UTI comme un outil bénéfique qui peut être utilisé pour modéliser UTI chez les humains ^22,26-28.

Alors que la majorité des femmes ressentent une infection urinaire dans leur vie, le résultat de ces infections peut varier de l'infection de l'auto-limitation aiguë sans récidive, à la cystite récidivante fréquente. En outre, des études ont montré une forte survenue familiale de l'UTI, ce qui suggère une composante génétique contribue à la susceptibilité ²⁹ UTI. Nous avons constaté que les résultats UTI différentes dans les cliniques peuvent être reflétés par les résultats différents de l'infection expérimentale UPEC entre souches consanguines de souris ^30. Par exemple, C3H / poule, l'ABC, Des souris DBA, et C3H / HeOuJ sont sensibles, de manière infectieux dépendante de la dose, de longue durée, la cystite chronique caractérisée par la persistance, les bactéries de titre élevé (> 10 ⁴ unités formant des colonies (CFU) / ml), un titre élevé de bactéries charges de la vessie au sacrifice> 4 semaines post-infection (WPI), l'inflammation chronique, et la nécrose urothelial. Ces souris présentent également des taux sériques élevés de IL-6, G-CSF, KC, et IL-5 dans les 24 premières HPI qui servent de biomarqueurs pour le développement de la cystite chronique. Cela peut représenter fidèlement le cours naturel des infections urinaires chez certaines femmes, que des études contre placebo ont montré qu'un grand pourcentage de femmes victimes de UTI conservera des niveaux élevés de bactéries dans l'urine pendant plusieurs semaines après les premiers symptômes de la cystite si pas donné un traitement antibiotique ^{31 , 32.} En outre, en utilisant des souris C3H / poule, nous avons constaté que des antécédents de cystite chronique est un facteur de risque important pour les infections récurrentes sévères ultérieures. Infection urinaire récidivante est le plus simanifestation clinique gnificant de l'UTI et la souris C3H / HeN est actuellement le seul modèle étudié qui récapitule une prédisposition accrue après l'exposition précédente. Un deuxième résultat UTI est récapitulée dans C57Bl / 6 souris où l'infection aiguë UPEC est auto-limitation, avec une résolution de l'inflammation de la vessie et bactériurie une semaine environ. Fait intéressant, dans ce modèle, UPEC former facilement des réservoirs intracellulaires de repos dans le tissu de la vessie à partir de laquelle UPEC sont capables de sortir d'un état ​​de dormance pour relancer une UTI actif, potentiellement expliquer un mécanisme de même souche UTI récurrent chez l'homme ^{33, 34.}

En plus des influences génétiques sur UTI susceptibilité, l'introduction d'un cathéter dans la vessie augmente considérablement la probabilité d'avoir une infection ainsi que l'augmentation du nombre de bactéries capables de provoquer une infection. Il a été démontré que le cathétérisme urinaire humaine provoque histologique etchangements immunologiques dans la vessie dus au stress mécanique qui entraîne une réponse inflammatoire robuste, exfoliation, œdème de la lamina propria et submucusa, amincissement urothelial et lésion de la muqueuse urothélium et les reins ^35,36. En outre, le cathéter offre une surface pour la fixation bactérienne créant ainsi un environnement utilisé par plusieurs espèces de provoquer Cauti. Alors que UPEC sont encore un contributeur majeur, Enterococcus faecalis représente 15% de ces Cauti ^37. E. faecalis est de plus en plus résistantes aux antibiotiques avec résistance à la vancomycine émergence, posant un grave problème de santé ^38. E. faecalis possèdent de nombreux facteurs de virulence y compris les toxines et adhésines nécessaires pour la fixation à la fois le cathéter et l'épithélium ^38. Pendant sondage urinaire, l'hôte est vulnérable à l'adhésion microbienne, la multiplication et la diffusion dans le ^39,40 urinaire. E. FAECAlis forme un biofilm sur le cathéter dans le cadre d'un mécanisme de persister dans la vessie et de diffuser vers les reins, qui est reproduite dans un modèle de souris Cauti ^41. Récemment, il a été montré pendant un cathétérisme urinaire, fibrinogène (Fg) est libéré dans la vessie dans le cadre de la réponse inflammatoire. Fg accumule dans la vessie, le cathéter couches et est essentielle pour E. faecalis formation de biofilm, fonctionnant comme un échafaudage de fixation. Dans un modèle de souris C57BL / 6 de la souris de Cauti, nous avons découvert que E. faecalis formation de biofilm sur le cathéter, et donc la persistance dans la vessie, était à la charge sur le pili Ebp, spécifiquement son EBPA pointe d'adhésine. Nous avons constaté que le domaine N-terminal de EBPa se lie spécifiquement à FG revêtement du cathéter. En outre, il a été constaté que E. faecalis utilise Fg comme source de métabolite cours de l'infection, améliorant ainsi la formation de biofilm ^42.

Des modèles de souris sont révélés indispensables à undertanding ainsi que la prévision des manifestations cliniques de l'UTI et Cauti ^41. Dans cet article, nous démontrons la préparation de l'inoculum de la cystite UPEC isolons UTI89 et l'inoculation transurétrale de souris C3H / poule. En outre, nous démontrons un protocole pour l'insertion du cathéter dans des souris C57BL / 6 et de l'inoculation E. souche faecalis OG1RF. Ces deux techniques conduisent à UTI ou Cauti cohérente et fiable chez la souris. Nous affichons également des techniques utilisés pour observer la formation IBC au cours cystite aiguë et la collecte d'urine pour l'analyse de la cystite chronique ou récurrente. Souris C3H / HeN ont été utilisées pour étudier les aspects de la pathogenèse UPEC y compris invasion initiale bactérienne, la formation IBC, filamentation et le développement de la cystite chronique ^23,33,43. Ces paramètres de virulence ont également été étudiés dans une variété d'autres milieux de souris ^22,33. Pour Cauti, C57BL / 6 modèle permet pour l'implantation d'un corps étranger dans la vessie avec le co bactérienne ultérieureionisation, qui peut être maintenu pendant 7 jours après l'infection ^41. Ces modèles ont été utiles pour évaluer les mécanismes de virulence bactérienne, les réponses de l'hôte aux infections urinaires et des mécanismes de subvertir réponses de l'hôte, dont une grande partie a été ensuite récapitulées ou observés dans les populations humaines cliniques.

Protocol

Déclaration éthique: Le Comité des études animales Université de Washington a approuvé toutes les infections et les procédures souris dans le cadre de numéro de protocole 20120216, qui a été approuvé et expire 11/01/2013 11/01/2016. Prise en charge globale des animaux était compatible avec le guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches et le Guide des ressources Soins USDA animale. procédures d'euthanasie sont compatibles avec les "directives…

Representative Results

Les modèles intravésicale d'UTI associée simple et le cathéter fournissent des plates-formes flexibles pour élucider les mécanismes moléculaires de la pathogénie bactérienne, l'impact de ces maladies sur les tissus de l'hôte, et le développement et l'essai de nouvelles approches pour gérer ces infections courantes et coûteuses. Selon la souche de souris et pathogène, l'inoculation intravésicale peut être utilisée pour étudier les interactions hôte-pathogène à élucider les facteu…

Discussion

Communauté simple acquis UTI est une infection courante et coûteuse qui représente plusieurs millions de visites de soins primaires chaque année ^46. En outre, CAUTIS sont une infection acquise de santé commun qui est devenu extrêmement coûteux pour les fournisseurs de soins de santé que les Centres de services Medicare et Medicaid ne rembourse les fournisseurs pour le coût supplémentaire de traitement résultant de l'hôpital acquis Cauti ^45. Les modèles de souris de l'UTI, tant …

Materials

Material for catheter and needle preparation:
30ga needles	BD Precision Glide	305106	30Gx ½ (0.3 mm x 13mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 mL
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs – Stainless Steel – Large Capacity –
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 in
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 in x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1X Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299