Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)
Summary
Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.
Abstract
Los límites a la resolución óptica y el reto de identificar poblaciones específicas de proteína en microscopía electrónica de transmisión han sido obstáculos en la biología celular. Muchos fenómenos no se pueden explicar mediante análisis in vitro en los sistemas simplificados y necesitan información estructural adicional in situ, en particular en el rango entre 1 nm y 0,1 m, con el fin de ser plenamente comprendido. Aquí, imágenes espectroscópicas de electrones, una técnica de microscopía electrónica de transmisión que permite el mapeo simultáneo de la distribución de las proteínas y ácidos nucleicos, y una etiqueta de expresión, miniSOG, se combinan para estudiar la estructura y organización de ADN de doble hebra focos romper la reparación.
Introduction
A pesar de los importantes avances en microscopía de luz en los últimos años 1, celulares biólogos todavía sufren de una brecha en la resolución. Esto limita la comprensión de las relaciones estructura-función en los procesos celulares fundamentales que implican la interacción coordinada entre los complejos macromoleculares (por ejemplo, en remodelación de la cromatina, la reparación del ADN, el ARN transcripción y replicación de ADN). Aunque los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) es proporcionar la resolución necesaria, ha sido un reto para definir estos procesos estructuralmente debido a la incapacidad para etiquetar proteínas específicas al mismo tiempo ser capaz de determinar la composición bioquímica de las estructuras visualizadas. En ausencia de membranas internas para ayudar a diferenciar las estructuras nucleares, el núcleo ha sido particularmente difícil. Electron espectroscópica de imágenes (ESI) resuelve algunas de estas limitaciones, permitiendo la detección simultánea y diferenciación de ADN, ARN y protein-basada estructuras nucleares 2-5.
Electron imágenes espectroscópicas:
Con el fin de mapear las distribuciones elementales a alta sensibilidad y resolución en el microscopio electrónico, se puede usar un espectrómetro de imágenes que selecciona los electrones que han sido dispersos inelásticamente través de interacciones con electrones de la capa interior de un elemento en la muestra 6. Puesto que las cantidades de elementos específicos de la energía se pierden como consecuencia de la ionización de los átomos en la muestra, estos electrones se pueden separar y se visualizaron usando un espectrómetro que está unido al microscopio electrónico. Por lo tanto, el análisis del espectro de los electrones que han interactuado con el espécimen revela información cualitativa y cuantitativa acerca de la composición elemental de la muestra 7. Los electrones que no pierden energía cuando pasa a través de la muestra se encuentran en el "pico de pérdida cero" de la pérdida de energía de electronesespectro. La abundancia de estos electrones se relaciona con la masa, densidad y espesor de la muestra y se compone de electrones que pasan a través de la muestra sin chocar con la muestra o la pérdida de energía durante el paso a través de la muestra. Esta información puede ser útil para la cuantificación absoluta de los números de átomos de un elemento específico presente en la muestra 8.
Dado que las muestras biológicas consisten principalmente de elementos ligeros que mal desvían los electrones en el haz incidente de la TEM, métodos de tinción usando sales de metal pesado tienen que ser aplicados con el fin de generar contraste en la muestra. La falta de especificidad de la mayoría de estos agentes de contraste y la incapacidad para visualizar más de una mancha donde es posible especificidad ha limitado el valor de la microscopía electrónica convencional en el estudio del núcleo. ESI tiene ventajas significativas sobre TEM convencional, en particular para el estudio de las estructuras del núcleo de la célula.Es posible explotar la naturaleza rica en fósforo de ADN y complejos macromoleculares que contienen ARN para distinguir los complejos de nucleoproteína de complejos de proteínas y para resolver diferentes complejos de nucleoproteína en función de su densidad de ácidos nucleicos. El material biológico restante se pueden obtener imágenes en base a su abundancia de nitrógeno. Asignación de sólo estos dos elementos y el análisis de su distribución y abundancia relativa dentro de las diferentes estructuras anatómicas nos proporciona una gran cantidad de información sobre el núcleo. Por ejemplo, es fácil identificar la cromatina y los ribosomas en el mapa que representan la abundancia de fósforo. El espacio interchromatin, complejos de poro nucleares, y los cuerpos nucleares, por otro lado, pueden detectarse fácilmente en la imagen del mapa de nitrógeno.
Mini sistema generador de oxígeno singlete (miniSOG)
Mientras ESI representa una poderosa técnica para el estudio de la estructura de la cromatina in situ, ya que tomas ventaja de las relaciones característicos en la composición elemental entre el fósforo y el nitrógeno, la composición elemental no puede normalmente ser usada para discriminar entre diferentes poblaciones de complejos de proteínas. Anticuerpos marcados con pequeñas partículas de oro en el rango nanométrico se han utilizado ampliamente para mapear la localización de moléculas individuales. Dado que la partícula de oro generalmente se une a un anticuerpo secundario, aparecerá dentro de una circunferencia de aproximadamente 20 nm alrededor del epítopo detectado por el anticuerpo primario. En las muestras post incrustación, los anticuerpos sólo pueden detectar los epítopos que están expuestos en la superficie de las secciones. Si bien es posible demostrar la presencia de un antígeno y relacionarlo con una cierta estructura anatómica de la célula, la información que se obtiene es incompleta, ya que la mayoría de los epítopos están oscurecidos por la resina. Técnicas, que utilizan protocolos similares a los utilizados para la microscopía de fluorescencia Pre-incrustación, permitir el acceso a los antígenos a lo largotoda la profundidad de la muestra pero los pasos de permeabilización que se requieren para permitir que el anticuerpo para penetrar en la célula típicamente requieren la eliminación de las membranas lipídicas y eliminar componentes que no pueden ser corregidos por aldehídos. Por otra parte, el fijador aldehído preferido para la preservación ultraestructura, glutaraldehído, comúnmente destruye epítopos y, en consecuencia, paraformaldehído se requiere típicamente. Esto es menos efectivo en la reticulación proteína-proteína. Otra desventaja de los anticuerpos que se etiqueta con una nanopartícula de oro es que el oro es un material muy denso en electrones que crea un fuerte contraste que puede oscurecer los detalles estructurales interesantes de la muestra, que tiene más débil contraste.
La aparición de la proteína verde fluorescente (GFP) como una etiqueta proteína expresada ha transformado el uso de microscopía de fluorescencia para responder a preguntas de la biología celular. Etiquetado de una proteína con un pequeño dominio fluorescente permite el mapeo de su distribución in vivo </em> sin la necesidad de procedimientos de permeabilización que pueden alterar la estructura. Con el fin de traducir el principio elegante de la utilización de etiquetas de proteínas para mapear las distribuciones de proteínas en una célula de Microscopía Electrónica, se necesitaba un sistema que es capaz de producir una señal de cerca de la estructura de interés y generar contraste en el TEM. Diaminobencidina polimerizado es una mancha que se utiliza a menudo en la histología para detectar la unión del anticuerpo. Esta mancha se deposita normalmente utilizando peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con un anticuerpo secundario. Aunque la reacción produce un resultado fiable, HRP no es catalíticamente activo en el citosol de las células 9. Los productos de reacción de HRP pueden también difunden lejos del lugar de generación de modo que su resolución es peor que el método Nanogold 10. Con el fin de evitar estos problemas, el sistema / ReAsH FLASH fue desarrollado 11. Se compone de proteínas de fusión recombinantes que poseen un motivo tetracisteína. Este motivo permite la unión deun fluoróforo biarsenic. Cuando excitado, el flash consolidado o ReAsH es capaz de generar el oxígeno atómico altamente reactivo y diaminobencidina tanto photoconvert (DAB) en un polímero que precipita inmediatamente en el lugar de las proteínas etiquetadas. El polímero DAB se puede teñir con tetróxido de osmio, que es denso en electrones y por lo tanto se puede utilizar para mapear la distribución de la proteína de fusión recombinante en el TEM.
En 2011, Shu et al. 10 presentó el sistema miniSOG, que consiste en una pequeña 106 amino ácidos etiqueta de fusión derivada de una flavoproteína de Arabidopsis que es fluorescente y capaz de crear muchos radicales de oxígeno singlete cuando se excita con luz azul 448 nm. Estos radicales de oxígeno singlete se pueden utilizar para diaminobencidina foto-oxidar para formar polímeros en y cerca de la superficie de la proteína etiquetada, que es considerablemente más estrecha que los anticuerpos marcados inmunoelectrónica 11. Mientras que el sistema de flash / ReAsH requiere llevar el flúorcromo y la diaminobenzidina en las células antes de hacer la fotoconversión, el sistema miniSOG sólo requiere diaminobencidina y la luz y, además, es dos veces más eficaz en la polimerización de diaminobencidina. Aquí, miniSOG se emplea en combinación con ESI con el fin de mapear la ultraestructura de focos de reparación del ADN.
Focos de reparación del ADN (DRF)
ADN no reparado doble filamento se rompe representan una seria amenaza para la célula, ya que pueden dar lugar a translocaciones y pérdida de información genética. A su vez, esto puede conducir a la senescencia, el cáncer y la muerte celular. Muchas proteínas que están implicadas en la reparación de ADN de doble filamento romper acumulan en los focos que reunir en torno a una doble cadena de ADN romper 12-14. Aunque su función no se conoce, que representan el sitio en el núcleo que contiene el ADN de doble capítulo romper y es el sitio de ADN de doble hebra de romper la reparación.
Foc reparación del ADNi (DRF) se han caracterizado por microscopía de fluorescencia y servir como biomarcadores de daño en el ADN 12,15. Ellos son enormes en relación con el tamaño de la rotura de doble cadena y se consideraron relativamente homogénea hasta que los estudios de microscopía de super-resolución recientes revelaron algunas pruebas de sub-compartimentación de moléculas en cada enfoque 16. Con el fin de entender cómo se organizan estos sitios, es necesario para visualizar todas las estructuras biológicos subyacentes respecto a la otra. Esto no se puede lograr mediante microscopía de fluorescencia, pero es posible a través de microscopía electrónica 17,18. Aquí, se describe un método que combina imágenes espectroscópicas de electrones con el método miniSOG para ilustrar el potencial de este enfoque combinado para explorar la ultraestructura de reparación del ADN de doble filamento romper.
Protocol
Representative Results
Discussion
ESI puede servir como una herramienta excelente para examinar diferentes estados de la cromatina y ribonucleoproteínas en el núcleo debido a que es capaz de asignar específicamente a las zonas que son ricos en fósforo. Es profundamente aumenta la cantidad de detalle que se puede obtener por un microscopio electrónico y no depende de los métodos de contraste no específicos. Una desventaja de ESI es que requiere secciones más delgadas que TEM convencional al mismo voltaje de aceleración. Esto se puede superar med…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | lifetechnologies | 16000-044 | |
| G418 | lifetechnologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
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