Nós apresentamos protocolos que permitem refinados no monitoramento vivo da função motor no mouse. Técnicas para medir o potencial de ação muscular composto (CMAP) eo número de unidade motora de estimativa (MUNE) nos músculos dos membros posteriores do mouse inervados pelo nervo ciático são descritos.
Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the functional status of a motor unit pool in vivo. These measures can provide insight into the normal development and degeneration of the neuromuscular system. These measures have clear translational potential because they are routinely applied in diagnostic and clinical human studies. We present electrophysiological techniques similar to those employed in humans to allow recordings of mouse sciatic nerve function. The CMAP response represents the electrophysiological output from a muscle or group of muscles following supramaximal stimulation of a peripheral nerve. MUNE is an electrophysiological technique that is based on modifications of the CMAP response. MUNE is a calculated value that represents the estimated number of motor neurons or axons (motor control input) supplying the muscle or group of muscles being tested. We present methods for recording CMAP responses from the proximal leg muscles using surface recording electrodes following the stimulation of the sciatic nerve in mice. An incremental MUNE technique is described using submaximal stimuli to determine the average single motor unit potential (SMUP) size. MUNE is calculated by dividing the CMAP amplitude (peak-to-peak) by the SMUP amplitude (peak-to-peak). These electrophysiological techniques allow repeated measures in both neonatal and adult mice in such a manner that facilitates rapid analysis and data collection while reducing the number of animals required for experimental testing. Furthermore, these measures are similar to those recorded in human studies allowing more direct comparisons.
Número da unidade Motor estimativa (MUNE) foi originalmente descrito por McComas et al. mais de três décadas atrás 1. A técnica original era uma modificação da técnica de gravação do potencial de ação muscular composto (CMAP), que empregou um aumento gradual de estimulação para obter incrementos submáximas. Estes incrementos foram somados e média para determinar um tamanho estimado de um potencial de unidade único motor (SMUP). Esta foi dividida em tamanho a resposta CMAP para estimar o número de unidades motoras que inervam o músculo a ser testado. Na sequência da descrição original, numerosas variações e com as duas reacções electrofisiológicas e força medições incrementais (mecânicos) têm sido utilizados em ambos os estudos humanos e modelos animais 2. A técnica de MUNE foi modificado pela Shefner e colegas para investigar modelos de ratos com Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) 3, 4.
Na descrição atual, detalhamos Simplifmodificações IED do MUNE técnicas que são rápidos para executar. Importante, CMAP e MUNE permitir medidas de confiança em ambos os ratos recém-nascidos e adultos 5-8. Indivíduos experientes podem executar essas medidas em 10-20 min por animal, e medidas repetidas são viáveis que permite a aquisição de dados longitudinais 5. Nos estudos atuais, que empregam um sistema electrodiagnostic clínica. Em nossa experiência, os sistemas electrodiagnostic clínicos são otimizados para a captura rápida e eficiente de dados eletrofisiológicos in vivo, plataformas eletrofisiológicos no entanto padrão pode facilmente ser adaptado para esta aplicação.
MUNE e CMAP são medidas clinicamente relevantes freqüentemente utilizados em estudos de investigação e no monitoramento de pacientes com doenças neuromusculares, como a ALS e atrofia muscular espinhal (AME) 9, 10. Por exemplo, no SMA, CMAP e MUNE correlacionam-se bem com a idade, gravidade e clínica medidas de função 10-14. Ambas as medidas são minimamente invasivos e permitir a avaliação da função longitudinalmente no mesmo indivíduo. É importante ressaltar que estas medidas não se pode medir a ativação ou recrutamento da unidade motora por neurônios do córtex motor, mas eles fornecem uma avaliação clinicamente relevante da integridade do neurônio motor eo seu homólogo funcional, a unidade do motor.
Os modelos animais de doença neuromuscular são críticas para a compreensão dos mecanismos patogénicos da doença humana e para o desenvolvimento pré-clínico de agentes terapêuticos potencialmente eficazes. A capacidade de traduzir medidas de resultados e biomarcadores que podem serutilizado em várias espécies podem facilitar e acelerar a concretização dos resultados pré-clínicos promissores para testes clínicos em humanos. Vários grupos já utilizou as duas medidas eletrofisiológicas e de força (mecânicos) para estimar função unidade do motor em modelos do rato 2-4, 15-22. Devido à relativa complexidade das medidas, temos refinado estas técnicas em um formato visual para permitir o uso mais disseminado e implementação em camundongos. O formato de vídeo de demonstração e instrução, permite principais etapas do procedimento a ser destacado e potenciais armadilhas a serem abordados. A aplicação destas técnicas para testes pré-clínicos de terapias potenciais em doenças motoras neuronais pode melhorar a tradução de terapias putativos dos ratos para a doença humana.
Há vários passos críticos no processo de aquisição das respostas CMAP e MUNE. A colocação do eletrodo de gravação adequada e consistente e contato suficiente com o eletrodo traseiramembro são críticos para a medição da amplitude e reprodutível para diminuir o ruído de fundo. Portanto, um contacto estreito entre traseira da pele do membro e eletrodos devem ser consistentemente confirmado. Descobrimos que eletrodos de superfície oferecem mais consistentes gravações CMAP e MUNE do que eletrodos de agulha. Devido aos tecidos subcutâneos muito finos, pequenos movimentos da superfície de gravação agulha pode levar a grande variação na amplitudes CMAP. Além disso, a natureza mais invasiva de eletrodos de agulha não é o ideal para os ratos neonatais ou estudos longitudinais devido ao rompimento potencial muscular e lesões. Uma desvantagem potencial de eléctrodo de superfície, gravações não selectivos relaciona-se com a possibilidade de resolução fenótipo enfraquecidas se um músculo em particular é mais ou menos envolvido em comparação com outro, e esta tem sido relatada em um modelo de ratinho de ALS 21.
Adquirir o tamanho médio SMUP é tecnicamente mais difícil em comparação com a CMAP. Devido às menores responsTamanho E (na gama de mais do que mV mV) o ruído de fundo pode ser mais problemático. O ruído de fundo pode ser reduzido, ajustando o eletrodo terra, cátodo, ânodo, e verificando outros equipamentos eléctricos perto da configuração experimental. Uma gaiola de Faraday, normalmente utilizados para aplicações de electrofisiologia intracelulares, não é necessária. A determinação visual das respostas SMUP individuais é a habilidade mais difícil de adquirir e requer prática para resultados consistentes com repetibilidade adequada. É importante assegurar que as SMUPs que estão a ser gravados iniciar dentro da duração da resposta máxima CMAP. Nós definimos critérios para a aceitação de respostas incrementais individuais para tornar esse processo mais simples de executar e para aumentar a confiabilidade intra e inter-avaliadores.
Uma desvantagem potencial da técnica MUNE incrementais inclui a possibilidade de superestimar o número de unidades motoras funcionais devido a alternância de motounidades r. Nós usamos uma técnica semelhante para Shefner et al. em que cada resposta deve ser visto de forma reprodutível um total de 3 vezes para reduzir o impacto deste fenómeno 3.
Em nossa experiência, os sistemas electrodiagnostic clínicos são otimizados para os estudos aqui descritos devido à ergonomia melhorada interface do sistema examinador-electrodiagnostic permitindo facilidade de controle. O sistema de dois canais, utilizados no nosso laboratório está equipado com dois canais não comutado amplificador usando um amplificador com 24 bits conversor analógico para digital e uma taxa de amostragem de 48 kHz por canal. Ganho de Hardware pode ser ajustado de 10nV a 100 mV / divisão. O filtro de baixa freqüência tem um alcance de 0,2 Hz-5 kHz, e as configurações de filtro de alta freqüência variar de 30 Hz-10 kHz. Um estimulador de corrente constante é usada (intensidade: 0-100 mA; duração: 0,02-1 ms). A maioria dos sistemas clínicos têm características apropriadas semelhantes e pode ser ajustado para gravar adequadamente CMAP e MUNE respostas. UMAdditionally, sondas electrofisiológicos padrão podem ser montadas adequadamente para gravar e CMAP MUNE, mas a interface pode necessitar de ser ajustada para facilitar o ajuste da estimulação e a rápida identificação de CMAP SMUP e respostas.
Temos anteriormente utilizadas as técnicas de CMAP e MUNE descrito aqui para permitir a avaliação rápida e reprodutível do ciático muscular inervado do membro posterior em ratos durante o período pós-natal precoce para a idade adulta 5. Estas técnicas permitem a avaliação em modelos do rato quando o teste comportamental para a função motora não é viável ou é menos confiável. A aplicação desta técnica para ratos neonatal facilita o estudo do desenvolvimento da unidade motora e tem o potencial para expandir nossa compreensão da inervação do neurônio motor e poda. Por exemplo, demonstramos que o número de unidades motoras funcionais gravados com MUNE irá aumentar durante a poda de polyneuronal a inervação mononeuronal durante as duas primeiras semanass de vida em ratos neonatal 5. A capacidade para testar ratinhos durante longos períodos de tempo com esta técnica presta-se para o estudo da resposta da unidade motora para a lesão do nervo periférico, distúrbios neuromusculares hereditárias e envelhecimento.
The authors have nothing to disclose.
WDA is supported by grant funding from NIH-NICHD (5K12HD001097-17) and Cure SMA. SJK is supported by grant funding from NINDS (K08NS067282 and U01NS079163).
Pro trimmer Pet Grooming Kit | Oster | 078577-010-003 | clippers for hair removal |
Synergy T2 EMG system | Natus Neurology | Model no longer available | portable electrodiagnostic system |
monopolar needles 28 gauge | Teca | 017K121 | cathode and anode stimulating electrodes |
Alpine Biomed Digital Ring Electrode with twisted wires and 1.5 mm TP connectors. | Alpine Biomed | 9013S0312 | recording electrodes |
Helping Hands alligator clip with iron base | Radio Shack | 64-079 | Maintaining recording electrode placement |
Spectra 360 Electrode Gel | Parker Laboratories | 9013G5012 | applied to reduce skin impedance |
monoject curved tip irrigating syringe | Covidien | 81412012 | utilized for application of electrode gel |
EMG needle cable | Teca | 902-RLC-TP | to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator |
Disposable 2" x 2" Electrode or similar trimmed as needed | Carefusion | 019-415000 | ground electrode |
Small Heating Plate with built-in RTD sensor, 15x10cm | World Precision Instruments | 61830 | warming plate used with animal temperature controller to transmit heat to animal |
Silicone pad for use with ATC2000 | World Precision Instruments | 503573 | conductive removable pad to cover warming plate for easy cleaning |
Animal temperature controller | World Precision Instruments | ATC2000 | low noise animal heating system for maintaining animal temperature |
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment | Puralube | 26870 | applied during anesthesia to avoid corneal injury |