Nous présentons raffinés protocoles qui permettent à la surveillance in vivo de la fonction de l'unité de moteur dans la souris. Techniques pour mesurer le potentiel d'action composé de muscle (CMAP) et le numéro de bloc moteur estimation (MUNE) dans les muscles des membres postérieurs de la souris innervés par le nerf sciatique sont décrits.
Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the functional status of a motor unit pool in vivo. These measures can provide insight into the normal development and degeneration of the neuromuscular system. These measures have clear translational potential because they are routinely applied in diagnostic and clinical human studies. We present electrophysiological techniques similar to those employed in humans to allow recordings of mouse sciatic nerve function. The CMAP response represents the electrophysiological output from a muscle or group of muscles following supramaximal stimulation of a peripheral nerve. MUNE is an electrophysiological technique that is based on modifications of the CMAP response. MUNE is a calculated value that represents the estimated number of motor neurons or axons (motor control input) supplying the muscle or group of muscles being tested. We present methods for recording CMAP responses from the proximal leg muscles using surface recording electrodes following the stimulation of the sciatic nerve in mice. An incremental MUNE technique is described using submaximal stimuli to determine the average single motor unit potential (SMUP) size. MUNE is calculated by dividing the CMAP amplitude (peak-to-peak) by the SMUP amplitude (peak-to-peak). These electrophysiological techniques allow repeated measures in both neonatal and adult mice in such a manner that facilitates rapid analysis and data collection while reducing the number of animals required for experimental testing. Furthermore, these measures are similar to those recorded in human studies allowing more direct comparisons.
Moteur numéro d'unité estimation (MUNE) a été initialement décrit par McComas et al. Il ya 1 plus de trois décennies. La technique originale est une modification du potentiel d'action musculaire composé (CMAP) Technique d'enregistrement qui utilise une augmentation progressive de la stimulation afin d'obtenir des incréments sous-maximales. Ces augmentations ont été additionnées et moyennées pour déterminer une taille d'environ un potentiel de l'unité de moteur unique (SMUP). Cette taille a été divisée en réponse CMAP pour estimer le nombre d'unités motrices innervant le muscle testé. Après la description originale, de nombreuses variations à l'aide de deux réponses électrophysiologiques et vigueur progressive des mesures (mécaniques) ont été utilisés dans les deux études humaines et des modèles animaux 2. La technique MUNE a été modifié par Shefner et ses collègues d'enquêter sur des modèles murins de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) 3, 4.
Dans la description actuelle, nous détaillons simplifIED modifications des techniques MUNE qui sont rapides à effectuer. Surtout, le CMAP et MUNE permettent des mesures fiables dans les deux souris néonatales et adultes 5-8. Individus expérimentés peuvent effectuer ces mesures en 10-20 min par animal, et des mesures répétées sont réalisables qui permet l'acquisition de données longitudinales 5. Dans les études actuelles, nous employons un système électrodiagnostique clinique. Dans notre expérience, les systèmes électrodiagnostiques cliniques sont optimisés pour la capture rapide et efficace des données électrophysiologiques in vivo, les plates-formes électrophysiologiques néanmoins standard peuvent être facilement adaptés pour cette application.
MUNE et CMAP sont des mesures cliniquement pertinentes fréquemment utilisés dans les études de recherche et dans le suivi des patients atteints de maladies neuromusculaires comme la SLA et l'atrophie musculaire spinale (SMA) 9, 10. Par exemple, dans SMA, CMAP et MUNE sont bien corrélés avec l'âge, la gravité et clinique mesures de la fonction 10-14. Ces deux mesures sont minimalement invasive et permettent évaluation de la fonction longitudinalement dans le même individu. Fait important, ces mesures ne peuvent pas mesurer l'activation ou le recrutement de l'unité de moteur par les motoneurones corticaux, mais ils fournissent une évaluation cliniquement pertinente de l'intégrité du neurone moteur et son équivalent fonctionnel, l'unité de moteur.
Les modèles animaux de maladie neuromusculaire sont essentiels à la compréhension des mécanismes pathogènes de la maladie humaine et le développement préclinique des agents thérapeutiques potentiellement efficaces. La capacité à traduire les mesures des résultats et des biomarqueurs qui peuvent êtreutilisé à travers les espèces peuvent faciliter et accélérer l'application des résultats précliniques prometteurs à des essais cliniques humains. Plusieurs groupes ont déjà utilisé les deux mesures électrophysiologiques et de force (mécaniques) pour estimer la fonction de bloc moteur dans des modèles de souris 2-4, 15-22. En raison de la relative complexité des mesures, nous avons affiné ces techniques dans un format visuel pour permettre une utilisation plus répandue et la mise en œuvre chez la souris. Le format de la vidéo de démonstration et de l'instruction, permet étapes clés de la procédure à être mis en évidence et les pièges potentiels qui seront abordés. L'application de ces techniques à des essais précliniques de thérapies potentielles dans les maladies du motoneurone peut améliorer la traduction des thérapies putatives de souris à la maladie humaine.
Il ya plusieurs étapes critiques dans le processus d'acquisition des réponses CMAP et MUNE. Le placement des électrodes d'enregistrement appropriée et cohérente et le contact de l'électrode suffisant avec la bichemembres sont essentiels pour la mesure reproductible de l'amplitude et de diminuer le bruit de fond. Par conséquent, un contact étroit entre la peau derrière des membres et des électrodes doit être constamment confirmée. Nous avons trouvé que des électrodes de surface et offrent CMAP MUNE enregistrements plus cohérente que les électrodes à aiguilles. En raison de tissus sous-cutanés très minces, de petits mouvements de surface d'enregistrement de l'aiguille peuvent conduire à grande variation dans amplitudes CMAP. En outre, la nature plus envahissante des électrodes aiguilles est pas optimale pour les souris néonatales ou des études longitudinales en raison de la perturbation de potentiel musculaire et des blessures. Un inconvénient potentiel de l'électrode, des enregistrements de surface non sélectifs concerne la possibilité de résolution réduite si le phénotype de muscle particulier est plus ou moins impliqués par rapport à un autre, ce qui a été rapporté dans un modèle de souris ALS 21.
L'acquisition de la taille moyenne des SMUP est techniquement plus difficile par rapport à la CMAP. En raison des petites responstaille de e (dans la gamme de mV plutôt que mV) bruit de fond peut être plus problématique. Le bruit de fond peut être réduite en ajustant l'électrode de masse, la cathode, l'anode, et de vérifier un autre équipement électrique à proximité de l'installation expérimentale. Une cage de Faraday, typiquement utilisé pour des applications d'électrophysiologie intracellulaire, est pas nécessaire. Détermination visuelle des réponses individuelles de SMUP est la compétence la plus difficile à acquérir et prend la pratique pour des résultats cohérents avec une bonne reproductibilité. Il est important de veiller à ce que les SMUPs qui sont enregistrées à l'intérieur initier la durée de la réponse maximale du CMAP. Nous avons défini des critères d'acceptation des réponses individuelles supplémentaires pour rendre ce processus plus simple à réaliser et à augmenter la fiabilité intra- et inter-évaluateur.
Un inconvénient potentiel de la technique MUNE incrémentale inclut la possibilité de surestimer le nombre d'unités motrices fonctionnelles dues à l'alternance de motounités de r. Nous avons utilisé une technique similaire à Shefner et al. en ce que chaque réponse doit être considérée de manière reproductible un total de 3 fois de réduire l'impact de ce phénomène 3.
Dans notre expérience, les systèmes électrodiagnostiques cliniques sont optimisés pour les études décrites ici grâce à l'amélioration ergonomie des interfaces du système examinateur-électrodiagnostique permettant la facilité de contrôle. Le système à deux canaux utilisé dans notre laboratoire est équipé de deux canaux d'amplification non-commuté en utilisant un amplificateur à 24 bits convertisseur analogique-numérique et un taux de 48 kHz par voie d'échantillonnage. Gain de matériel peut être ajustée de 10nV à 100 mV / division. Le filtre basse fréquence a une portée de 0,2 Hz à 5 kHz, et les paramètres de filtre haute fréquence varie de 30 Hz-10 kHz. Un stimulateur à courant constant est utilisé (intensité: 0-100 mA; durée: 0,02-1 ms). La plupart des systèmes cliniques ont des caractéristiques similaires appropriés et peuvent être ajustés pour enregistrer correctement les réponses CMAP et MUNE. UNn outre, les plates-formes électrophysiologiques standard peuvent être assemblés pour enregistrer adéquatement CMAP et MUNE, mais l'interface peut être nécessaire d'ajuster pour la facilité d'ajustement de la stimulation et l'identification rapide des réponses CMAP et SMUP.
Nous avons déjà utilisé les techniques de CMAP et MUNE décrit ici pour permettre une évaluation rapide et reproductible de la sciatique musculaire innervée de la patte postérieure chez la souris pendant la période postnatale précoce à l'âge adulte 5. Ces techniques permettent d'évaluer des modèles de souris lors des tests de comportement pour la fonction motrice est pas possible ou est moins fiable. L'application de cette technique à des souris néonatale facilite l'étude du développement moteur de l'unité et a le potentiel d'élargir notre compréhension de neurone moteur innervation et l'élagage. Par exemple, nous avons montré que le nombre d'unités motrices fonctionnelles enregistrées avec MUNE va augmenter lors de la taille de polyneuronale innervation mononeuronal pendant les deux premières semainess de la vie chez la souris néonatale 5. La capacité à tester souris sur de longues périodes de temps avec cette technique se prête bien à l'étude de la réponse de l'unité de moteur à une lésion du nerf périphérique, des troubles neuromusculaires héréditaires et le vieillissement.
The authors have nothing to disclose.
WDA is supported by grant funding from NIH-NICHD (5K12HD001097-17) and Cure SMA. SJK is supported by grant funding from NINDS (K08NS067282 and U01NS079163).
Pro trimmer Pet Grooming Kit | Oster | 078577-010-003 | clippers for hair removal |
Synergy T2 EMG system | Natus Neurology | Model no longer available | portable electrodiagnostic system |
monopolar needles 28 gauge | Teca | 017K121 | cathode and anode stimulating electrodes |
Alpine Biomed Digital Ring Electrode with twisted wires and 1.5 mm TP connectors. | Alpine Biomed | 9013S0312 | recording electrodes |
Helping Hands alligator clip with iron base | Radio Shack | 64-079 | Maintaining recording electrode placement |
Spectra 360 Electrode Gel | Parker Laboratories | 9013G5012 | applied to reduce skin impedance |
monoject curved tip irrigating syringe | Covidien | 81412012 | utilized for application of electrode gel |
EMG needle cable | Teca | 902-RLC-TP | to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator |
Disposable 2" x 2" Electrode or similar trimmed as needed | Carefusion | 019-415000 | ground electrode |
Small Heating Plate with built-in RTD sensor, 15x10cm | World Precision Instruments | 61830 | warming plate used with animal temperature controller to transmit heat to animal |
Silicone pad for use with ATC2000 | World Precision Instruments | 503573 | conductive removable pad to cover warming plate for easy cleaning |
Animal temperature controller | World Precision Instruments | ATC2000 | low noise animal heating system for maintaining animal temperature |
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment | Puralube | 26870 | applied during anesthesia to avoid corneal injury |