L'application d'un système d'expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

Résumé

La méthode décrite ici est utilisée pour induire la cascade de signalisation apoptotique à des étapes définies afin de disséquer l’activité d’une protéine effectrice bactérienne anti-apoptotique. Cette méthode peut également être utilisée pour l’expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer l’interférence avec d’autres voies de signalisation.

Résumé

La technique présentée ici permet d'analyser une étape au cours de laquelle une protéine cible, ou en variante, une petite molécule, interagit avec les composants d'une voie de signalisation. La méthode est basée, d'une part, sur l'expression inductible d'une protéine spécifique pour initier un événement de signalisation à un pas prédéterminé et défini dans la cascade de signalisation sélectionné. Expression concomitante, d'autre part, du gène d'intérêt permet alors l'investigateur d'évaluer si l'activité de la protéine cible exprimée est situé en amont ou en aval de l'événement de signalisation initiée, en fonction de l'affichage de la voie de signalisation qui est obtenue. Ici, la cascade apoptotique a été choisi comme une voie de signalisation définis pour démontrer la fonctionnalité de protocole. Les bactéries pathogènes, telles que Coxiella burnetii, translocation des protéines effectrices qui interfèrent avec l'induction de la mort de la cellule hôte dans la cellule hôte afin d'assurer la survie des bactéries dans la cellule et pour promouvoir leurla diffusion dans l'organisme. Les C. protéines effectrices burnetii CAEB inhibe efficacement la mort de la cellule hôte après l'induction de l'apoptose avec la lumière UV ou à la staurosporine. Pour affiner à quelle étape CAEB interfère avec la propagation du signal apoptotique, protéines sélectionnées ayant une activité pro-apoptotique bien caractérisé ont été exprimés de manière transitoire dans une manière de doxycycline inductible. Si CAEB agit en amont de ces protéines, l'apoptose se dérouler librement. Si CAEB agit en aval, la mort cellulaire sera inhibée. Les protéines d'essai ont été sélectionnés Bax, qui agit au niveau de la mitochondrie, et de la caspase 3, ce qui est la principale protease exécuteur. CAEB interfère avec la mort cellulaire induite par l'expression de Bax, mais pas par la caspase 3 expression. CAEB, par conséquent, coopère avec la cascade apoptotique entre ces deux protéines.

Introduction

La virulence de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatif dépend de systèmes de sécrétion spécialisés de détourner des cellules hôtes eucaryotes. Les bactéries utilisent ces systèmes de sécrétion d'injecter des protéines de virulence bactérienne (effecteurs) dans la cellule hôte afin de moduler une variété d'activités cellulaires et biochimiques. L'étude des protéines effectrices a non seulement fourni un remarquable aperçu sur les aspects fondamentaux de interactions hôte / pathogène mais aussi dans la biologie fondamentale des cellules eucaryotes ^1. La modulation de l'apoptose de la cellule hôte a été démontré être un mécanisme de viru....

Protocole

1. Génération de lignées cellulaires stables exprimant la protéine d'intérêt

1. Préparer les médias par l'ajout de FCS inactivé à la chaleur et 1% de pénicilline / streptomycine à disponibles dans le commerce Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec du GlutaMAX-I, le pyruvate, et 4,5 g / L de D-glucose.
2. Cultiver des cellules HEK293 dans un milieu à 37 ° C dans 5% de _CO2. Sous-cultiver les cellules tous les trois jours. Retirez les médias et remettre les cellules dans 15 ml de médias fraîches. Pipette de 1 ml dans un nouveau 75 cm ² de culture cellulaire ballon et ajouter 14 ml médias.
3. Analyser le....

Résultats

Premièrement, des lignées de cellules HEK293 exprimant de manière stable la protéine d'intérêt (CAEB) en tant que protéine de fusion GFP ont été établies. A titre de témoin, les lignées cellulaires HEK293 exprimant de manière stable GFP ont également été générées. L'expression de la GFP et GFP-CAEB a été vérifiée par analyse par immunotransfert. Le représentant immunoblot (figure 4A) démontre l'expression stable et clairement détectable de la GFP et GFP-CAEB. Cependant, ce test ne peut déter.......

Discussion

De nombreuses bactéries pathogènes hébergent des systèmes de sécrétion ou de sécréter des protéines effectrices translocation bactérienne dans la cellule hôte. Ces protéines effectrices ont la capacité de moduler les processus et les voies dans la cellule hôte, ce qui permet aux bactéries de survivre et de se répliquer à l'intérieur de leur niche intracellulaire respectif. Comprendre les activités biochimiques et les mécanismes moléculaires des protéines effectrices aidera à une meilleure compréhension de la pathogé.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	life technologies	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pen/Strep	life technologies	15140-122
OptiMEM	life technologies	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Geneticin	Roth	CP11.3
Polyéthylénimine	Polysciènes	23966
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD Cellule de transfert semi-sèche	Bio-Rad	170-3940
PageRuler Échelle de protéines précolorées	Thermo Scientific	26616
Membrane	PVDFMillipore	IPVH00010
anti-GFP  ;	life technologies	A6455
anti-clivé PARP	BD Bioscience	611038
anti-actine	Sigma Aldrich	A2066
IgG de souris (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
IgG de lapin (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
Substrat de transfert Western	ECL Thermo Scientific	32106
Tampon de décapage Restore Plus Western Blot	Thermo Scientific	46428