Induzione e valutazione di ischemia-riperfusione Injury in Langendorff-perfusi Hearts Rat
Summary
The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.
Abstract
The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.
Introduction
Delucidazione degli eventi di riferimento la risposta cardiaca sia ischemia e riperfusione sono essenziali per migliorare il trattamento di infarto 1 e cardiache procedure chirurgiche che richiedono miocardio clampaggio aortico 2. Mentre i modelli in vivo di ischemia riperfusione consentono analisi endpoint molto utili, essi non sono efficaci per studiare gli effetti funzionali di ischemia riperfusione acutamente in tempo reale. Inoltre, de modelli di ischemia riperfusione vivo producono generalmente significativa variabilità nelle dimensioni dell'infarto e consegna diretta di farmaco al cuore al momento della riperfusione è impegnativo. L'utilizzo di un sistema Langendorff cuore isolato per studiare il danno da ischemia riperfusione permette valutazione funzionale in tempo reale di trattamenti farmacologici, superficie uniforme tessuto infartuato e consegna istantanea di farmaco direttamente al miocardio.
Prima descritto by Oscar Langendorff nel 1895 3, il cuore Langendorff isolato è un modello affidabile per lo studio di ischemia riperfusione, essendo stato utilizzato nella ricerca ischemia riperfusione per gli ultimi 40 anni di 4,5. Qui, alcune modifiche sono fatte per ottimizzare il cuore isolato per l'analisi funzionale. In situ incannulamento dell'aorta mentre il cuore batte assicura che il cuore non sperimenta precondizionamento ischemico, tali da modificare i risultati di studi ischemia riperfusione 6. Per facilitare ciò, viene eseguita una tracheotomia, consentendo la ventilazione e garantire la stabilità fisiologica del ratto durante l'intervento chirurgico. Il cuore è poi collegato a un camicia d'acqua colonna tortile vetro attraverso il quale tampone Krebs Henseleit avviene tramite perfusione retrograda direttamente nell'aorta. Un palloncino soluzione salina viene inserita nel ventricolo sinistro e collegato ad un trasduttore di pressione, che consente la misurazione in tempo reale delle pressioni dall'interno un ventricolod calcolo dei molteplici parametri funzionali. Al termine dell'esperimento, cuore viene lavata con soluzione salina fredda per arrestare la contrazione e flash congelati in azoto liquido per consentire l'analisi valle dei livelli di DNA, RNA e proteine. Così modificato, cuore perfuso Langendorff serve come un sistema efficace per il monitoraggio diretto degli effetti fisiologici degli interventi farmacologici in qualsiasi momento acutamente durante il danno da ischemia riperfusione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolato Il cuore perfuso di ratto può essere utilizzato con successo per studiare l'effetto di un intervento farmacologico in precondizionamento cardiaco in ischemia riperfusione 9. Tuttavia, ci sono alcuni passaggi essenziali alla procedura che deve essere standardizzato per garantire risultati riproducibili. Il mantenimento di una temperatura di 37,4 ° C all'interno del sistema è critico, in quanto anche lieve ipotermia e ipertermia può causare precondizionamento cardiaco 10,11. Il te…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa pubblicazione è stata sostenuta dalla Carolina del Sud Clinical & Translational Research (SCTR) Institute, con una casa accademico presso la Medical University of South Carolina, NIH / NCATS Concessione Numero UL1 TR000062. Ulteriore supporto è stato fornito da premio di merito VA BX002327-01 a DRM. DJH è stato sostenuto da NIH / NCATS Concessione Numero TL1 TR000061 e dal NIH di Grant Numero T32 GM008716. SEA è stato sostenuto da NIH di Grant Numero T32 HL07260.
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | 203726 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | RES20765-A7 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich | C8106 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Octanoic Acid | Sigma Aldrich | C2875 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Medical Pressure Transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| Masterflex Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07521-40 | |
| Masterflex Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-07518-10 | |
| Heated circulating water bath | Lauda | M3 | |
| Tubing Flow Module | Transonic | TS410 | |
| Modular Research Console | Transonic | T402 | |
| Inline flow sensor | Transonic | ME2PXN | |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | PL3508 | |
| LabChart data acquisition software | AD Instruments | MLU60/8 |
References
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