Induksjon og vurdering av iskemi-reperfusjon Injury in Langendorff-perfuserte rottehjerter

Summary

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Abstract

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

Introduction

Klarlegging av hendelsene underliggende hjerte respons på både iskemi og reperfusjon er avgjørende i å forbedre behandlingen av hjerteinfarkt ¹ og hjerte kirurgiske prosedyrer som krever aortic kryssklem ^to. Selv om in vivo-modeller av iskemi reperfusjonsskade tillate meget nyttig sluttpunktanalyse, er de ikke så effektive for å studere de funksjonelle virkninger av iskemi reperfusjonsskade akutt i sanntid. I tillegg, in vivo ischemia reperfusjons-modeller generelt produsere betydelig variasjon i infarktstørrelsen, og direkte levering av medikament til hjertet ved tidspunktet for reperfusjon er utfordrende. Utnyttelsen av et Langendorff-hjerte isolert system for å studere iskemi reperfusjonsskade muliggjør sanntids funksjonelle vurderingen av farmakologiske behandlinger, ensartet område av infarkt vev, og øyeblikkelig levering av legemiddel direkte til myokard.

Først beskrevet by Oscar Langendorff i 1895 ^3, er Langendorff isolert hjerte et robust modell for å studere iskemi reperfusjonsskade, etter å ha blitt brukt i ischemi reperfusjon forskning i de siste 40 årene ^4,5. Her er noen endringer gjort for å optimalisere den isolerte hjerte for funksjonell analyse. In situ kanylering av aorta mens hjertet er juling sikrer at hjertet ikke oppleve iskemisk prekondisjonering, noe som ville endre resultatene av iskemi reperfusjons prøvelser ^6. For å lette dette, er en tracheotomy utført, slik at ventilasjon og sikre fysiologiske stabilitet av rotte under operasjonen. Hjertet blir deretter festet til et glass med vannkappe spiral kolonne Krebs Henseleit buffer blir levert via perfusjon retrograd gjennom hvilken direkte inn i aorta. En salt-fylt ballong blir satt inn i venstre hjertekammer og festet til en trykktransduser, som gir mulighet for sanntids måling av trykk fra inne i et hjertekammerd beregning av flere funksjonelle parametere. Ved avslutningen av forsøket, hjertet er spylt med kald saltløsning for å arrestere sammentrekning og flash-frosset i flytende nitrogen for å gjøre det mulig genetisk analyse av DNA, RNA og proteinnivåer. Således modifiserte tjener Langendorff perfusert hjerte som et effektivt system for direkte overvåkning av den fysiologiske effekten av farmakologiske intervensjoner som helst i løpet av akutt iskemi reperfusjonsskade.

Protocol

Alle prosedyrer er oppført her har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Medical University of South Carolina. Forsøkene som beskrives her er akutte, ikke-overlevelse eksperimenter. Som sådan, er det ingen bruk av øye salve og en steril operasjonssalen er ikke nødvendig. Avlivning er oppnådd ved blodtapping under høsting av hjertet. 1. Experimental Forberedelse Sett opp enten et konstant trykk eller konstant strøm Langendorff Perfusjons Apparatus …

Representative Results

Venstre ventrikkel ballong apparat muliggjør sanntidsovervåking av trykket utviklet av avtalen venstre ventrikkel (figur 1). Som tidligere beskrevet 7, kan dette trykk trase kan brukes til å beregne mange av parametrene av ventrikulær funksjon. Disse beregningene kan utføres i referansefase så vel som reperfusjon fase, i gjennomsnitt over flere traser i hver gruppe, og sammenlignet for å bestemme hvorvidt den farmakologisk intervensjon resulterte i hjerte forkondisjonering, som vi har …

Discussion

Den isolerte perfuserte rottehjerte med hell kan anvendes for å studere effekten av farmakologisk intervensjon på kardial iskemi prekondisjonering i reperfusjonsskade ^9. Det er imidlertid noen viktige skritt til prosedyre som må standardiseres for å sikre reproduserbare resultater. Å opprettholde en temperatur på 37,4 ° C i systemet er kritisk, som selv mild hypotermi og hypertermi kan forårsake hjerte prekondisjonering ^10,11. Den totale tiden det tar fra injeksjon av anestesi til fjerning …

Materials

Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8