Direkte Induktion af Hemogenic Endothelium og Blood af Overekspression af transkriptionsfaktorer i Human pluripotente stamceller
Summary
This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.
Abstract
Under udviklingen, opstår hæmatopoietiske celler fra en specialiseret undergruppe af endotelceller, hemogenic endotel (HE). Modeling HE udvikling in vitro er afgørende for mekanistiske undersøgelser af endotel-hæmatopoietisk overgang og hæmatopoietisk specifikation. Her beskriver vi en fremgangsmåde til effektiv induktion af HE fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) ved overekspression af forskellige sæt af transkriptionsfaktorer. Kombinationen af ETV2 og GATA1 eller GATA2 TF'er anvendes til at inducere HE med pan-myeloid potentiale, mens en kombination af GATA2 og TAL1 transkriptionsfaktorer muliggør produktion af HE med erythroide og megakaryocytisk potentiale. Tilsætningen af LMO2 til GATA2 og TAL1 kombination væsentlige accelererer differentiering og øger erythroide og megakaryocytiske celler produktion. Denne metode giver en effektiv og hurtig hjælp af HE induktion fra hPSCs og giver mulighed for observation af endotel-hematopoietic overgang i en kultur fad. Protokollen indeholder hPSCs transduktion procedurer og post-transduktion analyse af HE og blod stamceller.
Introduction
Den enestående evne af humane pluripotente stamceller (hPSCs) for at forny sig selv og til at differentiere til celler af de tre kimlag, herunder blod, gør dem til et værdifuldt redskab for de mekanistiske undersøgelser af hæmatopoietisk udvikling, modellering af blodsygdomme, lægemiddelscreening, toksicitetsundersøgelser og udvikling af cellulære behandlingsformer. Fordi blod dannelse i embryo provenuet fra hemogenic endotel (HE) gennem en endotel hæmatopoietisk overgang 1,2, vil genereringen af HE i kulturer være afgørende for at studere de molekylære mekanismer, der regulerer endotel til hæmatopoietisk overgang og hæmatopoietisk specifikation. Nuværende fremgangsmåder til studier af HE er baseret på induktionen af hematoendothelial differentiering i aggregater (EBS) med tilsætning af hæmatopoietiske cytokiner 3-5, og co-dyrkning af hPSCs med Hæmatopoietiske-støttende stromale celler 6,7 eller i todimensionale kulturer med ekstracellulære matricer og cytokines 8,9. Disse klassiske differentiering fremgangsmåder er baseret på indførelsen af eksterne signaler, der virker på celleoverfladen og initierende kaskader af molekylære veje, der til sidst fører til aktivering af transkriptionel program vejledende hematoendothelial udvikling. Således effektivitet hPSCs opdelinger i disse systemer er baseret på en effektiv induktion af disse signaler, signaltransduktion til cellekernen, og den resulterende aktivering af specifikke transkriptionelle regulatorer. Desuden studiet af HE i konventionelle differentiering kulturer kræver det yderligere trin til isolering af HE celler ved anvendelse af cellesortering. Her beskriver vi en enkel protokol til direkte induktion af HE og blod ved overekspression af hæmatopoietiske transkriptionsfaktorer. Denne fremgangsmåde giver mulighed for effektiv induktion af HE i en skål og direkte observation af endotel til hæmatopoietisk overgang uden behov for isolering af HE ved hjælp af en besværlig cellesortering procedure.
Dannelse af HE og blod fra humane pluripotente stamceller kan effektivt induceret af overekspression blot et par transkriptionsfaktorer (TFS). Den optimale kombination af TF'er stand til at inducere robust pan-myeloid hæmatopoiese fra hPSCs inkluderer ETV2 og GATA1 eller GATA2. I modsætning hertil kombination af GATA2 og TAL1 inducerer erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmering hPSCs gennem overekspression af disse faktorer adskiller hPSCs direkte til VE-cad + CD43 – CD73 – HE celler, der gradvist erhverve den hæmatopoietisk fænotype defineres ved ekspression af den tidlige hæmatopoietisk markør CD43 7. Denne lentiviral-metode til direkte programmering af menneskets pluripotente stamceller metode anvendes til generering af HE og blodceller for mekanistiske undersøgelser, undersøgelser af endotel til hæmatopoietisk overgangsproces og transkriptionel regulering af hæmatopoietisk udvikling og specifikation. Selvom CNUVÆRENDE protokol beskriver produktionen blod ved hjælp konstitutiv ekspression af transgenerne, kunne lignende resultater opnås ved hjælp af modificeret mRNA 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til hæmatopoietisk differentiering af hPSCs ved overekspression af TF'er, repræsenterer en hurtig og effektiv metode til generering af HE og myeloide og erytho-magakaryocytic progenitorer fra hESCs og iPSCs, således at produktionen af op til 30 millioner blodlegemer fra en million pluripotente stamceller 10. Denne metode udstillet konsekvent differentiering i flere hESC og iPSCs linjerne 10. Under differentiering ved ETV2 og GATA2, GATA1 faktorer sa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.
Materials
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture.
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ –>3’ | Reverse (Rev) 5’–>3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | — | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | — | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | — | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | — | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | — | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | — | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
