Ce protocole décrit l’induction efficace de l’endothélium hémogène et des progéniteurs hématopoïétiques multipotentiels à partir de cellules souches pluripotentes humaines via l’expression forcée de facteurs de transcription.
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Article de méthode
Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches
Dans cet article
Résumé
Résumé
Au cours du développement, les cellules hématopoïétiques proviennent de un sous-ensemble spécialisé de cellules endothéliales, l'endothélium hemogenic (HE). Modélisation HE développement in vitro est essentiel pour des études mécanistiques de la transition de l'endothélium hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Ici, nous décrivons un procédé efficace pour l'induction de IL partir de cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs) au moyen de la surexpression de différents ensembles de facteurs de transcription. La combinaison de ETV2 et GATA1 ou GATA2 TF est utilisé pour induire un potentiel SE pan-myéloïde, tandis qu'une combinaison de GATA2 et des facteurs de transcription TAL1 permet la production de IL avec érythroïde et mégacaryocytaire potentiel. L'ajout de LMO2 à GATA2 et la combinaison TAL1 accélère sensiblement la différenciation érythroïde et augmente et les cellules mégacaryocytaires production. Cette méthode offre un moyen efficace et rapide de SE l'induction de hPSCs et permet l'observation de l'endothélium hematopoietic transition dans une boîte de culture. Le protocole comprend des procédures hPSCs de transduction et l'analyse post-transduction de SE et des progéniteurs sanguins.
Introduction
La capacité unique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) d'auto-renouvellement et de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, y compris le sang, faire un outil précieux pour les études mécanistiques de développement hématopoïétique, la modélisation des maladies du sang, le dépistage des drogues, Les études de toxicité et le développement de thérapies cellulaires. Parce que la formation du sang dans l'embryon produit à partir de l'endothélium hemogenic (HE) à travers une transition hématopoïétique endothéliale 1,2, la génération de SE dans les cultures serait essentiel d'étudier les mécanismes moléculaires ....
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Protocole
1. préparations de virus et facteur de transcription Combinaisons
- Préparer des solutions avec pSIN EF1-lentiviral plasmide d'expression contenant l'ADN codant pour la protéine de ETV2, GATA1, GATA2, LMO2 et TAL1 (tableau 1).
- Mesurer la concentration et la pureté des préparations de plasmides utilisés pour la production lentiviral enregistrement par absorption UV avec un spectrophotomètre à 230 nm, 260 nm et 280 nm. Note: préparations d'ADN démontrant A260 / 280 et A260 / 230 des valeurs supérieures à 1,8 sont généralement considérés comme de bonne qualité. A260 / 280 valeurs inférieures peuvent indiquer une con....
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Résultats
Le schéma de SE et l'induction de sang de hPSCs par la surexpression de facteurs de transcription est montré dans la figure 1. ETV2 avec GATA1 ou GATA2 combinaison induit hématopoïèse pan-myéloïde, tandis qu'un GATA2, TAL1 +/- combinaison LMO2 induit hématopoïèse principalement érythro-mégacaryocytaire. Les deux combinaisons de TF directement induites cellules ES qui ont transformé ensuite en progéniteurs sanguins avec un spectre distinct de la différenciation hématopoïétique. D.......
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Discussion
La méthode décrite ci-dessus pour la différenciation hématopoïétique de hPSCs par la surexpression de TFS, représente une approche rapide et efficace pour la génération de SE et myéloïdes et erytho-magakaryocytic progéniteurs de CSEh et CSPi, permettant ainsi la production de jusqu'à 30 millions de cellules de sang de un million de cellules souches pluripotentes 10. Cette méthode présentait différenciation cohérente dans de multiples lignées de CSEh et CISP 10. Au cours de la différenciation pa.......
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Déclarations de divulgation
IS est un actionnaire fondateur et consultant pour Cynata.
Remerciements
Nous remercions Matt Raymond pour son aide rédactionnelle. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Institut national de la santé (U01HL099773, R01HL116221 et P51 RR000167) et de la Fondation Charlotte Geyer.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
Table 1. Induction de la différenciation des hPSCs avec des facteurs de transcription et analyse de l’endothélium hémogénique et des cellules sanguines. | |||
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro ; | Addgene | Plasmide #61061 | Vecteur lentiviral |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro ; | Addgene | Plasmide #61063 | Vecteur lentiviral |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro ; | Addgene | Plasmide #61062 | Vecteur lentiviral |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro ; | Addgene | Plasmide #61062 | Vecteur lentiviral |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro ; | Addgene | Plasmid #61064 | Vecteur lentiviral |
| Bromure d’hexadiméthrine (Polybrene) ; | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Polymère cationique utilisé pour augmenter l’efficacité de l’infection |
| Y-27632 (dichlorhydrate) Inhibiteur de ROCK | STEMCELL Technologies | 72302 | Inhibiteur de la voie RHO/ROCK Inhibe ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Réactif |
| Milieu de culture incomplet (sans facteur de croissance) ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; mTeSR1 Formulation personnalisée ; | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Milieu mTeSR1 sans sérum sans bFGF ni TGFb ; |
| humain SCF | Peprotech | 300-07 | |
| Maître TPO humain | Premium Peprotech | 300-18 | Grade |
| recherche FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Qualité Premium |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Marqueur endothélial (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hématopoïétique ( FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hématopoïétique (FACS) |
| CD73 APC | R& D Systems | FAB5795A | Marqueur endothélial (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences 555485 | Hématopoïétique (FACS) | |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Essai vivant/mort (FACS) |
| Paraformaldéhyde ; | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Fixation cellulaire |
| Triton X-100 ; | Sigma-Aldrich | T9284-500ML ; | Perméabilisation ; |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Sérum fœtal bovin |
| Souris anti-humain CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, anticorps primaire pour la coloration par immunofluorescence (IF) |
| Lapin anti-cadhérine humaine VE-cadhérine | BenderMedSystem | BMS158 | Primaire (IF) |
| Anti-lapin Alexa Fluor 488-conjugué | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondaire (IF) |
| Anti-souris Alexa Fluor 594-conjugué | JacksonResearch | 715-516-150 ; | Secondaire (IF) |
| Coloration à l’acide nucléique DAPI | Life Technologies | D1306 ; | Essai vivant/mort (IF) |
| Milieu clonogénique MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Coloration des cytospins |
Table 2. hPSCs culture. | |||
| Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ; | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) Cellules souches embryonnaires humaines ; iPSC (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) Cellules souches pluripotentes induites sans transgène | hPSC sont capables de s’auto-renouveler et de se différencier en cellules de trois couches germinales |
| Milieu complet sans sérum pour la culture de hPSC ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; mTeSR1 media ; ; | Institut de recherche WiCell (Madison, WI) | M500 ; | Milieu sans sérum avec facteurs de croissance pour la culture sans nourrissage d’ESC/iPSC |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning ; | 356234 | Matrice pour l’entretien des ESC/IPSC humains |
| DMEM/F-12, poudre ; | Life Technologies | 12500-062 | Milieu de Base ; |
| HyClone Dulbecco’s PBS poudre | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Protéase neutre, Dissociation cellulaire |
Table 3. Amorces pour la détection de l’intégration génomique du virus. | |||
| Nom de l’abécédaire | avant (avant) ; 5' -->3' | Reverse (Rev) 5'-->3' | Discription ; |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA- | - | EF1a séquence promotrice |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | ; Région de codage ; |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG& | NBSP ; Région de codage ; |
| TAL1 Rev | --AGG | CGG AGG ATC TCA TTC TT | ; Région de codage ; |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGA GGC | ; Région de codage ; |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC ; | ; Région de codage ; |
Références
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mo....
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Réimpressions et autorisations
