मानव स्टेम कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारक की overexpression द्वारा प्रत्यक्ष Hemogenic endothelium के प्रेरण और रक्त
Summary
This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.
Abstract
विकास के दौरान, hematopoietic कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं की एक विशेष सबसेट से उत्पन्न होती हैं, hemogenic अन्तःचूचुक (एचई)। इन विट्रो में मॉडलिंग वह विकास एन्दोथेलिअल-hematopoietic संक्रमण और hematopoietic विनिर्देश के यंत्रवत अध्ययन के लिए आवश्यक है। यहाँ, हम प्रतिलेखन कारक के विभिन्न सेट की overexpression के माध्यम से मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) से वह कुशल शामिल करने के लिए एक विधि का वर्णन है। GATA2 और TAL1 प्रतिलेखन कारकों के संयोजन एर्य्थ्रोइद और megakaryocytic क्षमता के साथ महामहिम के उत्पादन के लिए अनुमति देता है, जबकि ETV2 और GATA1 या GATA2 TFS के संयोजन, अखिल माइलॉयड क्षमता के साथ महामहिम प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। GATA2 और TAL1 संयोजन के लिए LMO2 के अलावा काफी भेदभाव accelerates और एर्य्थ्रोइद और megakaryocytic कोशिकाओं उत्पादन बढ़ जाता है। इस विधि hPSCs से महामहिम प्रेरण के एक कुशल और तेजी से साधन प्रदान करता है और endothelial-hematopoieti के अवलोकन के लिए अनुमति देता हैएक संस्कृति डिश में सी संक्रमण। प्रोटोकॉल hPSCs पारगमन प्रक्रियाओं और महामहिम के बाद पारगमन विश्लेषण और रक्त पूर्वज भी शामिल है।
Introduction
आत्म नवीकरण और रक्त सहित तीन रोगाणु परतों की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए, hematopoietic विकास के यंत्रवत अध्ययन के लिए उन्हें एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाने, रक्त रोगों के मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग के लिए मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) की अद्वितीय क्षमता, विषाक्तता अध्ययन, और सेलुलर उपचारों के विकास। एक endothelial hematopoietic संक्रमण 1,2 के माध्यम से (एचई) hemogenic अन्तःचूचुक से भ्रूण आय में रक्त गठन, संस्कृतियों में महामहिम की पीढ़ी hematopoietic संक्रमण और hematopoietic विनिर्देश के एन्दोथेलिअल के विनियमन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए आवश्यक होगा क्योंकि। वह पढ़ाई के लिए मौजूदा तरीकों hematopoiesis सहायक stromal कोशिकाओं 6.7 के साथ या बाह्य के साथ दो आयामी संस्कृतियों में hPSCs की hematopoietic साइटोकिन्स 3-5 के अलावा के साथ समुच्चय (ईबीएस) में hematoendothelial भेदभाव की प्रेरण, और coculture के आधार पर कर रहे हैं matrices और ग8,9 ytokines। इन शास्त्रीय भेदभाव तरीकों कोशिका की सतह पर अभिनय और अंततः hematoendothelial विकास मार्गदर्शक ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रम की सक्रियता के लिए नेतृत्व कि आणविक रास्ते के cascades की शुरुआत बाहरी संकेतों की शुरूआत पर आधारित हैं। इस प्रकार, इन प्रणालियों में hPSCs differentiations की दक्षता उन संकेतों का एक प्रभावी प्रेरण, नाभिक के संकेत पारगमन, और विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के परिणामस्वरूप सक्रियता पर निर्भर करता है। इसके अलावा, पारंपरिक भेदभाव संस्कृतियों में महामहिम के अध्ययन सेल छँटाई का उपयोग करते हुए महामहिम कोशिकाओं को अलग करने के लिए अतिरिक्त कदम की आवश्यकता है। यहाँ, हम hematopoietic प्रतिलेखन कारक की overexpression द्वारा वह और रक्त का सीधा शामिल करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस पद्धति का एक बोझिल सेल छँटाई प्रक्रिया का उपयोग कर महामहिम के अलगाव के लिए आवश्यकता के बिना एक पकवान और hematopoietic संक्रमण के लिए एन्दोथेलिअल के प्रत्यक्ष अवलोकन में महामहिम के कुशल शामिल करने के लिए अनुमति देता है।
मानव स्टेम कोशिकाओं से महामहिम के गठन और रक्त कुशलता से बस कुछ ही प्रतिलेखन कारक (TFS) overexpressing द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। hPSCs से मजबूत अखिल माइलॉयड hematopoiesis उत्प्रेरण के लिए सक्षम TFS का इष्टतम संयोजन ETV2 और GATA1 या GATA2 भी शामिल है। इसके विपरीत, GATA2 और TAL1 के संयोजन erythromegakaryocytopoiesis 10 लाती है। CD73 – – धीरे-धीरे जल्दी hematopoietic मार्कर CD43 7 की अभिव्यक्ति से परिभाषित hematopoietic फेनोटाइप प्राप्त है कि वह कोशिकाओं इन कारकों की overexpression के माध्यम से hPSCs प्रोग्रामिंग सीधे करने के लिए hPSCs VE-पाजी + CD43 differentiates। मानव स्टेम कोशिकाओं विधि का प्रत्यक्ष प्रोग्रामिंग के लिए यह lentiviral आधारित पद्धति यंत्रवत अध्ययन, रक्त संक्रमण के लिए एन्दोथेलिअल का अध्ययन, और hematopoietic विकास और विनिर्देश की ट्रांसक्रिप्शनल नियमन के लिए महामहिम और रक्त कोशिकाओं के उत्पादन के लिए लागू है। ग हालांकिurrent प्रोटोकॉल, इसी तरह के परिणाम संशोधित mRNA 10 का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता ट्रांसजीन के विधान अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए रक्त उत्पादन का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
TFS की overexpression द्वारा hPSCs की hematopoietic भेदभाव के लिए ऊपर वर्णित विधि, hESCs और जिससे अप करने के लिए 30 लाख रक्त कोशिकाओं के उत्पादन से इजाजत दी IPSCs, से वह और माइलॉयड और erytho-magakaryocytic पूर्वज की पीढ़ी के लिए एक तेजी से और कुशल दृष्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.
Materials
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture.
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ –>3’ | Reverse (Rev) 5’–>3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | — | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | — | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | — | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | — | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | — | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | — | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
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