Direkte Induksjon av Hemogenic endotelet og Blood av Overekspresjon av transkripsjonsfaktorer i Human Pluripotent stamceller

Summary

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Abstract

Under utviklingen hematopoetiske celler oppstå fra en spesiell undergruppe av endotelceller, hemogenic endotel (HE). Modellering HE utvikling in vitro er vesentlig for mekanistiske undersøkelser av endotelial-hematopoetiske overgang og hematopoetisk spesifikasjon. Her beskriver vi en fremgangsmåte for effektiv induksjon av HE fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) ved hjelp av overekspresjon av forskjellige sett av transkripsjonsfaktorer. Kombinasjonen av ETV2 og GATA1 eller GATA2 TFS blir brukt til å indusere HE med pan-myeloid potensiale, mens en kombinasjon av GATA2 og TAL1 transkripsjonsfaktorer gjør det mulig for produksjon av HE med erytroid og megakaryocytic potensial. Tilsetting av LMO2 til GATA2 og TAL1 kombinasjon vesentlig akselererer differensiering og øker erytroid og megakaryocytic celler produksjon. Denne metoden gir en effektiv og rask måte å HE induksjon fra hPSCs og tillater observasjon av endotelial-hematopoietic overgang i en kultur tallerken. Protokollen inkluderer hPSCs transduksjon prosedyrer og post-transduksjon analyse av HE og blodstamfedre.

Introduction

Den unike evnen av menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) å fornye seg selv og til å differensiere i celler av de tre bakterie lag, inkludert blod, gjøre dem et verdifullt verktøy for mekanistiske studier av blodkreft utvikling, modellering av blodsykdommer, narkotika screening, toksisitetsstudier, samt utvikling av mobilnettet terapier. Fordi bloddannelse i embryo inntektene fra hemogenic endotel (HE) gjennom en endothelial hematopoietisk overgang ^1,2, vil genereringen av HE i kulturer være avgjørende for å studere de molekylære mekanismene som regulerer endotelial til hematopoetiske overgang og hematopoetisk spesifikasjon. Aktuelle fremgangsmåter for studier av HE er basert på induksjon av differensiering i hematoendothelial aggregater (EBS) med tillegg av hematopoetiske cytokiner ^3-5, og coculture av hPSCs med hematopoiesis støttende stromaceller ^6,7 eller i to-dimensjonale kulturer med ekstracellulære matriser og cytokines ^8,9. Disse klassiske differensierings metoder er basert på innføring av eksterne signaler som virker på celleoverflaten og initiere kaskader av molekylære reaksjonsveier som til slutt fører til aktivering av transkripsjonen program førings hematoendothelial utvikling. Således effektiviteten av hPSCs differensiering i disse systemene er avhengig av en effektiv induksjon av disse signalene, signaltransduksjon til kjernen, og den resulterende aktivering av spesifikke transkripsjons regulatorer. I tillegg har studier av HE i konvensjonelle differensierings kulturer krever ytterligere trinn for isolering HE celler ved hjelp av cellesortering. Her beskriver vi en enkel protokoll for direkte induksjon av HE og blod ved overekspresjon av blodkreft transkripsjonsfaktorer. Denne metoden gjør det mulig for effektiv induksjon av HE i en skål og direkte observasjon av endotelial til hematopoetiske overgang uten behov for isolering av HE ved hjelp av en cellesortering tungvint prosedyre.

Dannelse av HE og blod fra menneskelige pluripotente stamceller kan effektivt indusert av overekspresjon bare noen transkripsjonsfaktorer (TFS). Den optimale kombinasjonen av TFS som kan indusere robust pan-myeloid hematopoiesen fra hPSCs inkluderer ETV2 og GATA1 eller GATA2. I kontrast, kombinasjon av GATA2 og TAL1 induserer erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmering hPSCs gjennom overekspresjon av disse faktorene skiller hPSCs direkte til VE-cad ⁺ CD43 ^– CD73 ^{– han} celler som gradvis erverve blodkreft fenotype definert av uttrykk for tidlig blodkreft markør CD43 ^7. Dette lentiviral basert metode for direkte programmering av human flerpotent stamceller Metoden er anvendelig for generering av HE og blodceller for mekanistiske undersøkelser, studier av endotelial til hematopoetiske overgang, og transkripsjonsregulering av hematopoetiske utvikling og spesifikasjon. Selv om cjeldende protokollen beskriver blod produksjon ved hjelp konstituerende uttrykk for transgener, lignende resultater kan oppnås ved hjelp av endret mRNA ^10.

Protocol

1. Virus Forberedelser og transkripsjonsfaktor Kombinasjoner Forbered løsninger med pSIN-EF1α lentiviral uttrykk plasmid som inneholder protein-kodende DNA for ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 og LMO2 (tabell 1). Måle konsentrasjonen og renheten av plasmid preparater som brukes for lentiviral produksjon ved å registrere UV-absorpsjon med et spektrofotometer ved 230 nm, 260 nm og 280 nm. Merk: DNA-preparater som viser A260 / 280 og A260 / 230-verdier større enn 1,8 er generelt an…

Representative Results

Skjemaet på HE og blod induksjon fra hPSCs av overekspresjon av transkripsjonsfaktorer er vist i figur 1. ETV2 med GATA1 eller GATA2 kombinasjon induserer pan-myeloid hematopoiesen, mens en GATA2, TAL1 +/- LMO2 kombinasjon induserer hovedsakelig erythro-megakaryocytic hematopoiesen. Begge TF kombinasjoner direkte indusert HE celler som deretter forvandlet til blodstamfedre med en tydelig spekter av blodkreft differensiering. Differensiering av hPSCs fra pluripotent tilstand til blodproduserende HE tar …

Discussion

Den ovenfor beskrevne metode for hematopoietisk differensiering av hPSCs ved overekspresjon av TFS, representerer en hurtig og effektiv metode for generering av HE og myeloide og erytho-magakaryocytic progenitorceller fra hESCs og iPSCs, for derved å tillate produksjon av opp til 30 millioner blodceller fra én million pluripotente stamceller ^10. Denne metoden viste konsekvent differensiering i flere hESC og iPSCs linjer ^10. Under differensiering av ETV2 og GATA2, GATA1 faktorer samt GATA2 og TAL1…

Materials

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins

Table 2. hPSCs culture.

Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation

Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.

Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ –>3’	Reverse (Rev) 5’–>3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	—	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	—	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	—	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	—	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	—	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	—	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region