Прямая индукция гемогенного эндотелия и крови сверхэкспрессией факторов транскрипции в человека плюрипотентные стволовые клетки
Summary
This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.
Abstract
Во время разработки, кроветворные клетки возникают из специализированного подмножества эндотелиальных клеток, кроветворный эндотелия (ОН). Развитие моделирования Его в пробирке имеет важное значение для механистических исследований эндотелия-гемопоэтических перехода и кроветворной спецификации. Здесь мы описываем способ эффективного индукции HE от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) путем сверхэкспрессии различных наборов транскрипционных факторов. Сочетание ETV2 и GATA1 или GATA2 ТФ используется, чтобы вызвать он, пан-миелоидный потенциала, в то время как комбинация GATA2 и TAL1 факторов транскрипции позволяет для производства он, эритроидных и мегакариоцитарной потенциала. Добавление LMO2 к GATA2 и комбинации TAL1 существенно ускоряет дифференциацию и увеличивает эритроидной и мегакариоцитарной клеток производства. Этот метод обеспечивает эффективное и быстрое средство индукции Его из hPSCs и позволяет для наблюдения эндотелиальной-hematopoietiС переходом в культуральной чашке. Протокол включает в себя процедуры hPSCs трансдукции и пост-трансдукции анализ он и предшественники крови.
Introduction
Уникальная способность человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) для самообновлению и дифференцировке в клетки трех зародышевых листков, в том числе крови, сделать их ценный инструмент для механистических исследований кроветворной развития, моделирования болезней крови, скрининг наркотиков, исследования токсичности и развитие клеточной терапии. Потому что образование в крови эмбриона выручки от гемогенного эндотелия (ОН) через эндотелиальной кроветворной перехода 1,2, генерация HE в культурах бы важно изучить молекулярные механизмы, регулирующие эндотелиальные к кроветворной перехода и кроветворной спецификации. Современные методы исследований HE основаны на индукции дифференциации в hematoendothelial агрегатов (EBS) с добавлением гемопоэтических цитокинов 3-5, и совместного культивирования в hPSCs с кроветворения-поддержку стромальных клеток 6,7 или в двумерных культур с внеклеточной матрицы и сytokines 8,9. Эти классические методы дифференциации основаны на введении внешних сигналов, действующих на поверхности клеток и инициирующих каскады молекулярных путей, которые в конечном итоге приводят к активации транскрипции программы руководящей hematoendothelial развития. Таким образом, эффективность hPSCs дифференциации в этих системах зависит от эффективной индукции этих сигналов, сигнальной трансдукции к ядру, и в результате активации специфических транскрипционных регуляторов. Кроме того, изучение HE в обычных культурах дифференцировки требует дополнительного шага изоляции HE клеток с использованием клеток сортировку. Здесь мы опишем простой протокол для прямого индукции он и крови по избыточной экспрессии кроветворных факторов транскрипции. Этот метод позволяет эффективно индукции HE в блюдо и непосредственного наблюдения за эндотелиальной к кроветворной перехода без необходимости выделения HE с использованием процедуры сортировки громоздким клеток.
Формирование он и кровь из человека плюрипотентных стволовых клеток может быть эффективно индуцируется с гиперэкспрессией всего несколько транскрипционных факторов (ТФ). Оптимальное сочетание ТФ, способных индуцировать надежную пан-миелоидный кроветворение из hPSCs включает ETV2 и GATA1 или GATA2. В отличие от этого, сочетание GATA2 и TAL1 вызывает erythromegakaryocytopoiesis 10. Программирование hPSCs через гиперэкспрессией этих факторов отличает hPSCs непосредственно к VE-хама + CD43 – CD73 – клетки, которые HE постепенно приобретают кроветворную фенотип определяется выражением раннего маркера CD43 гемопоэтических 7. Этот метод основан лентивирусов-за непосредственного программирования методом человека плюрипотентных стволовых клеток применяется для генерации он и клеток крови для механистических исследований, исследований эндотелиальных к кроветворной перехода и регуляции транскрипции гемопоэтических развития и спецификации. Хотя CПротокол омер текущего описано получение крови с помощью конститутивной экспрессии трансгенов, аналогичные результаты можно было бы получить с использованием модифицированной мРНК 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный выше метод кроветворной дифференциации hPSCs по избыточной экспрессии ТФ, представляет собой быстрое и эффективный подход для генерации он и миелоидных и erytho-magakaryocytic предшественников из ЭСК и ИПСК, тем самым позволяя производить до 30 миллионов клеток крови из один миллион плю?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.
Materials
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture.
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ –>3’ | Reverse (Rev) 5’–>3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | — | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | — | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | — | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | — | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | — | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | — | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
