İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan
Summary
This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.
Abstract
Gelişimi sırasında, hematopoietik hücreler endotel hücrelerinin özel bir alt grubundan elde edilen ortaya çıkan hemogenic endotel (HE). In vitro Modelleme HE geliştirme endotel-hematopoetik geçiş ve hematopoetik şartname mekanik çalışmalar için gereklidir. Burada, transkripsiyon faktörlerinin farklı setleri aşırı ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için HE etkin indüksiyonu için bir yöntem tarif eder. GATA2 ve TAL1 transkripsiyon faktörlerinin bir arada eritroid ve megakaryositik potansiyeli olan HE üretimine olanak sağlar ise ETV2 ve gata1 ya GATA2 TFs kombinasyonu, pan-miyeloid potansiyeli olan HE indüklemek için kullanılır. GATA2 ve TAL1 kombinasyonu LMO2 ilavesinin farklılaşmasını hızlandırır ve eritroid ve megakaryositik hücre üretimini arttırır. Bu yöntem, hPSCs gelen HE endüksiyon etkili ve hızlı bir yol sağlar ve endotelial-hematopoieti gözlem sağlarbir kültür kabı c geçişi. Protokol hPSCs transdüksiyon usul ve HE sonrası transdüksiyon analizi ve kan atalarıdır içerir.
Introduction
Kendini yenilemek ve kanda olmak üzere üç germ, hücre içine ayırt etmek, hematopoetik gelişim mekanik çalışmalar için onlara değerli bir araç yapmak, kan hastalıkları modellenmesi, ilaç taraması insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) benzersiz yeteneği, toksisite çalışmaları ve hücresel tedavilerin geliştirilmesi. Endotel hematopoetik geçiş 1,2 ile (HE) hemogenic endotel embriyo hasılatı kan oluşumu, kültürlerde HE nesil hematopoetik geçiş ve hematopoetik şartnameye endotelyal düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için gerekli olacaktır çünkü. HE çalışmaları için geçerli yöntem hematopoez destekleyici stromal hücreler 6,7 ya da hücre dışı olan iki boyutlu kültürlerde hPSCs hematopoietik sitokinlerin 3-5 ilavesi ile agrega (EBS) 'de hematoendothelial farklılaşmanın başlaması ve birlikte-kültür dayanmaktadır matrisler ve c8,9 ytokines. Bu, klasik yöntemler farklılaşma, hücre yüzeyinde hareket eden ve en sonunda hematoendothelial gelişimi yol transkripsiyonel program aktivasyonuna yol molekül yolların kaskadlar başlatılması harici sinyaller giriş dayanmaktadır. Bu nedenle, bu sistemlerde hPSCs farklılaşmalar etkinliği bu sinyallere etkili bir indüksiyonu, çekirdeğe sinyal iletimi, spesifik kopyalama düzenleyicilerinden oluşan elde edilen aktive edilmesine dayanır. Buna ek olarak, geleneksel bir farklılaşma kültürlerde HE çalışma hücre sıralama kullanarak HE hücrelerin izole edilmesi ek aşamasını gerektirmektedir. Burada, hematopoetik transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile HE ve kanın doğrudan indüksiyon için basit bir protokol açıklar. Bu yöntem, bir hantal hücre sıralama işlemi kullanılarak HE ayırmaya gerek olmadan, bir çanak ve hematopoietik geçiş endotelyal doğrudan gözlem HE etkin aşılanmasını da olanaklı kılar.
Insan pluripotent kök hücrelerden HE oluşumu ve kan verimli bir kaç transkripsiyon faktörlerini (TF) aşırı eksprese eden indüklenebilir. HPSCs gelen sağlam pan-miyeloid hematopoeze indükleyebilen TFs optimal kombinasyonu ETV2 ve gata1 veya GATA2 içerir. Bunun aksine, GATA2 ve TAL1 kombinasyonu erythromegakaryocytopoiesis 10 neden olur. CD73 – – yavaş yavaş, erken hematopoietik markör CD43 7 ekspresyonu ile tanımlanan hematopoietik fenotipi edinebilir HE hücreleri bu faktörlerin aşırı ekspresyonu yoluyla hPSCs Programlama şirketinden The için hPSCs VE-cad + CD43 ayırır. İnsan pluripotent kök hücreleri, bir yöntem doğrudan programlanması için bu lentiviral bazlı yöntem mekanik çalışmalar, hematopoietik geçiş endotelyal çalışmaları ve hematopoietik gelişimi ve tarifnamenin transkripsiyonel düzenleme için olan HE ve kan hücrelerinin üretimi için de geçerlidir. C rağmeneçerli protokolü benzer sonuçlar modifiye mRNA 10 kullanılarak elde edilebilir transgenlerin bünyesel anlatımı ile, kan üretimini açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
TFs aşırı ifadesi ile hPSCs hematopoietik farklılaşması için yukarıda tarif edilen yöntem olup, HESC ve böylece en fazla 30 milyon kan hücrelerinin üretimini gelen izin iPSCs gelen HE ve miyeloid ve eritropent-magakaryocytic öncüller için hızlı ve etkili bir yaklaşımı temsil etmektedir Bir milyon pluripotent kök hücreleri 10. Bu yöntem, çok sayıda HESC ve iPSCs hatları 10 tutarlı farklılık sergiledi. ETV2 ve GATA2 tarafından farklılaşma sırasında gata1 faktörleri …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.
Materials
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture.
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ –>3’ | Reverse (Rev) 5’–>3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | — | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | — | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | — | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | — | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | — | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | — | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
