In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
I mange år har forskning i neurodegenerative sygdomme som iskæmisk slagtilfælde eller traumatisk hjerneskade med fokus på udvikling af neurobeskyttende behandlinger, der har til formål at fremme neuronal overlevelse i akut slagtilfælde fase. Langt størstedelen af lægemiddelbehandlinger, der har vist sig at være effektiv i gnavermodeller mislykkedes, da oversat til klinikken. Årsager til denne terapeutiske svigt omfatter, men er ikke begrænset til de manglende vedvarende effekter narkotika resulterer i vedvarende funktionel neurologisk opsving. Det er derfor vigtigt at udvikle strategier, der fremmer hjerne remodeling på længere sigt. Eftersom fremme af neuronal overlevelse alene er ikke tilstrækkelig til at tillade vellykket slagtilfælde nyttiggørelse, som foreslået af det store antal af mislykkede forsøg neurobeskyttelse, stimulering neuronplasticitet har for nylig fået stor interesse på området.
Midler til lægemiddeltilførsel er intraperitoneal injektion, hale intravaskulær injection, femoral injektion, enkelt stereotaktisk injektion af vektorer ind i hjernen, og fortsatte konstant levering af miniosmotic pumper. Sidstnævnte kan omfatte systemisk levering, hvis pumpen ikke har en kanyle, eller som kan orgel-rettet, som vi har vist til levering i hjernen. Med undtagelse af miniosmotic pumper og anvendelsen af virale vektorer, vil alle andre strategier inducere fluktuerende stofkoncentrationer. For langsigtede eksperimenter det derfor bliver nødvendigt at sende dyret til stress af at modtage hyppige injektioner. BBB pålægger en vigtig hindring for hjernen optagelse af proteiner eller lægemidler fra blodet, hvilket resulterer i behovet for store protein- eller medikamentdoser med henblik på at opnå terapeutiske koncentrationer i hjernen. For eksempel Pellegrini et al. (2013) 5 leveres rhEpo ved intraperitoneal injektion i en dosis svarende til 75 IU / dag for et dyr af 30 g (750 IU / dag for en 300 g rotte). Til sammenligning målrettet levering af rhEpo til hjernen tilladt os at bruge en meget lavere dosis på kun 10 IU / dag i vores undersøgelse for vellykket slagtilfælde nyttiggørelse, som gjorde det muligt at opnå genopretning over en stor tidsskala til en fast rente på 0,25 gl / time.
I dette arbejde har vi vist fremgangsmåden til implantering af minipumper med en kanyle forbundet til skallen med henblik på at levere plasticitet-fremmende protein rhEpo direkte i ventriklen, således omgå BBB. Ved denne fremgangsmåde, rhEpo fremmes neurologisk opsving i en række måder, herunder reduktion af infarkt størrelse, reduktion af glial ardannelse og induktion af angiogenese. rhEpo også fremmet neuronal overlevelse og øget fremskrivninger fra contralesional motoriske hjernebark mod denerverede røde kerne og ansigts kerner. Spiring af fibrene blev afsløret ved indsprøjtning af anterograd tarmkanalen tracer BDA i motoren cortex (figur 4A og 5A). En funktionel korrelat til spiring af fibrene er provided med en forbedring af motoriske færdigheder (figur 5B). Derudover har vi vist, at den samme fremgangsmåde til tarmkanalen tracer injektion kan anvendes til at afsløre thalamo-hjernebarkforbindelser ved indsprøjtning af retrograd tarmkanalen tracer FG (figur 6B).
Ved fremstillingen af miniosmotic pumpe, er det vigtigt at overveje målpunktet og brugen af afstandsstykker. Vi bruger en afstandsholder for at reducere længden af kanylen ved 0,5 mm som på denne måde selve spidsen af nålen er i kontakt med ventriklen ved det givne koordinater (-0.2 mm caudale, 0,9 mm lateralt, 2,5 mm dorso ventrale, med hensyn til bregma). Men hvis dybere strukturer er målet for forskningen, så ingen afstandsstykker vil være behov for. Ligeledes, hvis der ønskes en mere ekstern leveringspunkt (dvs.., Cortex), derefter flere afstandsskiver vil være nødvendig. Kateteret skal være lang nok til, at pumpen ikke er for tæt på hovedet, da den vil hindre bevægelser af mouse, men også ikke alt for længe, når implanteret overdreven længde kan forårsage kateteret til at bøje, hvilket øger risikoen for kanylen fjernelse af den naturlige bevægelse af musen. Et afsnit på 2 cm af kateteret giver meget gode resultater med hensyn til mobilitet og stabilitet af implantatet (figur 1 og 2). Inkubation af pumpen ved 37 ° CO / N giver pumpen til straks begynde at pumpe lægemidlet ind i hjernen på tidspunktet for implantation.
I miniosmotic pumpe implantation er det vigtigt at sikre, at kraniet er korrekt tørres, før implantering af kanylen. Normalt rengøring med 70% Ethanol vil fremkalde knoglen til tørre, men hvis kontinuerlig blødning er fundet, vil røre kraniet forsigtigt med en cauterizer helt tør den. Det er afgørende at sikre, at indførelsen af nålen er så lodret og langsom som muligt. Når i position, og mens limen tørrer, placerer fingeren på toppen af kanylen forhindrer den i at bevæge sig til siden ovis kraniet. Der bør lægges særlig vægt på at såret og placering af kanylen. Det er vigtigt, at snittet ikke udføres nøjagtigt over midten linje af kraniet, men lidt til højre. Ved lukning af såret, hvis snittet er foretaget på den midterste linie, vil huden blive overbelastet, hvilket øger risikoen for sår åbning. Gør snittet lidt til den ene side vil gøre det muligt sutur punkter at være væk fra den højeste del af kanylen. Som følge heraf vil der være mindre spænding på sutur punkter og såret vil hele ordentligt. Dyrene bør bur alene og kontrolleres dagligt, især i de første 10-15 dage efter implantation. I tilfælde af sårruptur, sår skal lukkes så hurtigt som muligt. Hvis kanylen er fjernet eller dyret præsenterer en infektion, har forsøget til ophør. Re-implantation af kanylen frarådes. Det er meget vigtigt for en vellykket implantation at anvende tilstrækkelige mængder væv adhesive (ikke for meget!), da det nedbrydes knoglen og øger risikoen for kanylen fjernes. Men ved hjælp af for lidt lim vil heller ikke holde kanylen er knyttet til knoglen. De miniosmotic pumper kan bære medikamenter opløst i en bred vifte af stoffer, som er den eneste begrænsning til dette, at opløsningsmidlet er biokompatibel. Derudover, eftersom mængden er lille skal (200 pi) man bestemme, om fusionen er nødvendig for forsøget er egnet og vil ikke forårsage udfældning inde i pumpen.
Tarmkanalen sporing med enten anterograd eller retrograd sporstoffer er et meget veletableret teknik til at studere hjernens tilslutningsmuligheder og plasticitet. Pleje skal gives til brug stereotaktiske rammer, når injektion for at sikre nøjagtigheden om at målrette hjernen område man ønsker at studere (dvs. at forhindre injektion på hjernebjælken, når injektion cortex).
For alle kirurgiske indgreb og for at mindske smerter oginflammation, skal dyrene behandles med 0,1 mg / kg Buprenorphin før intervention og Caprofen ved 4 mg / kg én gang dagligt i tre dage efter indgrebet.
Afslutningsvis Denne fremgangsmåde giver en passende værktøj til at studere virkningen af proteiner eller farmakologiske forbindelser i skadede hjerne, der repræsenterer en fremgangsmåde, der er velegnet til undersøgelser af hjernens plasticitet.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |