Miniosmotic का आरोपण पंप्स और पथ Tracers की डिलिवरी pathophysiological शर्तों में ब्रेन पुनर्गठन का अध्ययन करने के लिए

Summary

In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.

Abstract

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.

Introduction

The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments ^1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain ^3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain ⁴. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug⁵. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen^2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor ^6,7.

Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections^8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity ^6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.

Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.

Protocol

पशु प्रयोगों सरकार की मंजूरी के साथ प्रदर्शन किया गया (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 और G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung डसेलडोर्फ) प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच के दिशा निर्देशों के आधार पर। Miniosmotic की 1. तैयारी पंप्स एक बाँझ वातावरण में (यानी।, सेल संस्कृति हुड), पंप, कैथेटर प्राप्त मॉडरेटर, मस्तिष्क अर्क प्रवेशनी और स्पेसर डिस्क का इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 1) प्रवाह। प्रवेशनी सुई के टिप वेंट्रिकल के साथ संपर्क में है कि इतने सीधे निलय में दवाओं के वितरण के लिए एक स्पेसर डिस्क का उपयोग करें। उल्टा एक संदंश के साथ प्रवेशनी पकड़ो। Cyanoacrylate चिपकने वाला (सीए) की दो बूँदें जोड़ें और एक स्पेसर डिस्क परिचय। ऊपर की ओर का सामना करना पड़ एक सपाट सतह पर प्रवेशनी छोड़ दें तो यह है कि स्पेसर डिस्क और प्रवेशनी सूख जाता है के बीच गोंद। के बारे में 2.5 सेमी की वर्गों में कैथेटर कट। ईए के लिएयह कैथेटर के भीतर बुलबुले के गठन को रोकने के लिए इसके अंदर पूरी तरह से इस प्रकार सब हवा extruding पंप को भरने के लिए आवश्यक हो जाएगा के रूप में चर्चा पंप, ब्याज के समाधान के 300-350 μl की एक न्यूनतम तैयार करते हैं। बुलबुले के प्रवाह को रोकना होगा मस्तिष्क में समाधान। ध्यान से प्रवाह मॉडरेटर को कैथेटर कनेक्ट। समाधान की एक छोटी राशि है, इस प्रकार यह अंदर हवा के बुलबुले को रोकने, पंप पलायन जब तक मस्तिष्क अर्क किट द्वारा प्रदान की सुई से जुड़ा एक 2 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, पंप भरें। ध्यान से प्रवाह मॉडरेटर भरने के लिए और ध्यान दे कैथेटर कैथेटर के अंदर शेष किसी भी बुलबुले को रोकने के लिए। पंप के अंदर प्रवाह मॉडरेटर परिचय दें। भरे जाने के बाद, ध्यान से कैथेटर के अंत तक प्रवेशनी कनेक्ट। यह एक बुलबुला प्रवेशनी को हटाने और ध्यान से वाहन या नशीली दवाओं के समाधान के साथ कैथेटर फिर से भरना और फिर प्रवेशनी reintroduce बनाई है कि मनाया जाता है। पु रखेंबाँझ खारा समाधान के साथ एक कंटेनर में सांसद और 37 डिग्री सीओ / एन पर छोड़ दें। आरोपण से पहले बुलबुला गठन के लिए पुनः जाँच। आवश्यक (यानी।, बुलबुले मनाया जाता है) तो प्रवेशनी हटाने और ट्यूब फिर से भरना। प्रवेशनी पुन: कनेक्ट करें। यह समाधान का केवल कुछ microliters लेना चाहिए। Miniosmotic 2. आरोपण पंप्स नोट: इन प्रयोगों जानवरों 1 isoflurane% (30% 2 हे, 70% एन 2 ओ) द्वारा anesthetized थे। यह उपलब्ध नहीं है, लेकिन अगर संज्ञाहरण की intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग भी 11 संभव है। संज्ञाहरण के तहत स्टीरियोटैक्टिक डिवाइस में पशु जानें और संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए एक सुरक्षात्मक मरहम के साथ आंखों को कवर किया। उंगलियों के साथ या एक संदंश के साथ जब दबाया hindpaw में उत्तर की कमी को देख कर संज्ञाहरण की पुष्टि करें। जानवर पूरी तरह से सो रहा है जब तक आगे बढ़ना नहीं है। वह खत्म फर कटकैंची या एक शेविंग मशीन के साथ या तो विज्ञापन। त्वचा को नुकसान पहुँचाए बिना संभव के रूप में ज्यादा कटौती। जीवाणुरोधी और कवकनाशी गुणों के साथ 70% इथेनॉल और कीटाणुनाशक के साथ त्वचा को साफ करें। एक छुरी के साथ midline के अधिकार के लिए थोड़ा एक 1 सेमी चीरा खुला और खोपड़ी को बेनकाब। एक कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी को साफ करें। 70% इथेनॉल के साथ यह लेना और खोपड़ी के ऊपर से गुजरती हैं। इस खोपड़ी को सुखाने के लिए प्रेरित करेगा। खोपड़ी प्रकाश खून बह रहा है, तो किसी भी खून बह अंक समाप्त करने के लिए एक cauterizer का उपयोग करें। रक्त नलिका को प्रत्यारोपित किया जाता है एक बार हड्डी पर ठीक से सुखाने से सीए को रोकता है। प्रवेशनी प्रत्यारोपित किया जाएगा, जहां खोपड़ी के मुद्दे पर एक छाप बनाने के लिए स्टीरियोटैक्टिक डिवाइस का प्रयोग करें। बाएँ गोलार्द्ध निर्देशांक पर वेंट्रिकुलर सुई लेनी के लिए -0.2 मिमी दुम, पर्वबिन्दु 0.9 पार्श्व मिमी (2A चित्रा) कर रहे हैं। धीरे से एक 45 डिग्री के कोण बनाने खोपड़ी के ऊपर ड्रिल; इस गलती से बीआरएआई में जाने से रोकता है ड्रिलएन। बार-बार कुछ सेकंड के लिए ड्रिल और फिर छेद कितना गहरा की जाँच करें। खोपड़ी पतला लेकिन अभी भी पूरी तरह से प्रवेश कर नहीं किया गया है एक बार ड्रिलिंग बंद करो। मस्तिष्क के लिए पूरा उपयोग हासिल की है, जब तक एक बाँझ सुई की नोक के साथ तानिका तोड़ो। मस्तिष्क को नुकसान नहीं करने के लिए इतनी के रूप में तो धीरे करो। एक कपास झाड़ू का उपयोग कर 70% इथेनॉल के साथ खोपड़ी को साफ करें। एक Antero दुम दिशा में जानवर की त्वचा के नीचे एक सीधे संदंश का परिचय। पंप प्रत्यारोपित किया जाएगा, जहां जानवर की पीठ में त्वचा के नीचे अंतरिक्ष खोलने के लिए संदंश का प्रयोग करें। बाहर कैथेटर और प्रवेशनी (चित्रा 2 बी) छोड़ने जानवर की पीठ में पंप परिचय दें। इसे हटा दिया जाता है और निर्धारण की किसी भी तरह की जरूरत नहीं है जब तक पंप इस स्थिति में रहेगा। ध्यान से अगले प्रवेशनी में सुई के लिए गोंद की चार छोटी बूंदों जगह है। ध्यान से यह बग़ल में ले जाए बिना खोपड़ी के माध्यम से सुई परिचय। 15-30 सेकंड के लिए स्थिति में पकड़ यूप्रवेशनी पूरी तरह से जुड़ा हुआ है ntil (चित्रा 2C.1)। एक स्पेसर डिस्क इस्तेमाल किया गया है, तो एक बार जगह में, प्रवेशनी dorso वेंट्रल दिशा में 2.5 मिमी तक पहुंच जाएगा। ठीक से जुड़ी हैं, तो प्रवेशनी प्रयोग के अंत तक हड्डी से जुड़ी रहेगी। हटाने योग्य टैब के ऊपर एक उंगली रखें और फिर कैंची का एक सेट (चित्रा 2C.2) के साथ अपनी गर्दन से उसे काट के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें। 5-0 सीवन के साथ त्वचा पर घाव बंद और (चित्रा 2 डी) के संक्रमण को रोकने के लिए घाव के शीर्ष पर povidone आयोडीन घोल (पीवीपी-आई) की कुछ बूँदें जोड़ें। एक नए पिंजरे में पशु ले जाएँ। अभी भी संचालित नहीं किया गया है कि जानवरों के साथ संचालित जानवरों जगह नहीं है। औषधि प्रशासन के समय के दौरान अपने पिंजरों में अकेले पंपों के साथ प्रत्यारोपित किया गया है कि जानवरों को रखने के। वे जाग रहे हैं और स्टर्नल लेटना आ गया है जब तक पहुंच से बाहर चूहों मत छोड़ो। 3. पम्प Removaएल नोट: आमतौर पर प्रयोग पंप द्वारा अनुमति प्रसव के समय के अंत में खत्म हो जाएगा, लेकिन यह एक दवा वितरण के लिए अनुवर्ती के रूप में माध्यमिक प्रयोग करने के लिए आदेश में पंप को दूर करने के लिए संभव है। पथ दरियाफ्त इंजेक्शन करने के लिए आदेश में यह पंप दूर करने के लिए इस प्रकार आवश्यक है। संज्ञाहरण के तहत seterotactic डिवाइस में पशु प्लेस और संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए सुरक्षात्मक मरहम के साथ आंखों को कवर किया। उंगलियों के साथ या एक संदंश के साथ जब दबाया hindpaw में उत्तर की कमी को देख कर संज्ञाहरण की पुष्टि करें। जानवर पूरी तरह से सो रहा है जब तक आगे बढ़ना नहीं है। ध्यान से पंप आरोपण के दिन पर किया चीरा के माध्यम से काटने से त्वचा खुला। एक शल्य क्लैंप के साथ प्रवेशनी पकड़ और इसे बाहर खींच। यह आसानी से खोपड़ी से हटा दिया जाना चाहिए। कोमल रक्तस्राव होने की उम्मीद है के रूप में, एक कपास झाड़ू रखकर इसे रोकने और 1-2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। कैथेटर द्वारा पंप बाहर खींचो। वहयह, इसे आगे बढ़ाने त्वचा पर दबाव बनाने के द्वारा बाहर आ एल.पी.। 5-0 सीवन के साथ फिर से घाव को बंद करें और पीवीपी-मैं की कुछ बूँदें जोड़ें। एक नए पिंजरे में पशु ले जाएँ। क्या अभी भी संचालित नहीं किया गया है कि जानवरों के साथ संचालित जानवरों डाल नहीं। सर्जरी आया है कि पशु एक साथ रखा जा सकता है। वे जाग रहे हैं और स्टर्नल लेटना आ गया है जब तक पहुंच से बाहर चूहों मत छोड़ो। पशु पथ दरियाफ्त इंजेक्शन के लिए आगे बढ़ने से पहले 10 दिनों के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें। सही मोटर कॉर्टेक्स पर 45 डिग्री के कोण पर 4. दबाव पथ अनुरेखक इंजेक्शन संज्ञाहरण के तहत स्टीरियोटैक्टिक डिवाइस पर पशु प्लेस और संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए एक सुरक्षात्मक मरहम के साथ आंखों को कवर किया। उंगलियों के साथ या एक संदंश के साथ जब दबाया hindpaw में उत्तर की कमी को देख कर संज्ञाहरण की पुष्टि करें। जानवर पूरी तरह से सो रहा है जब तक आगे बढ़ना नहीं है। सिर घाव खोलें। सी70% इथेनॉल एक कपास झाड़ू का उपयोग के साथ खोपड़ी दुबला। डिवाइस की खड़ी धारक पर एक 5 μl कांच सिरिंज (26S गा) परिचय दें। गिलास धारक के निचले छोर पकड़े टुकड़ा पर ठीक है सुनिश्चित करें। तो यह ऊर्ध्वाधर स्थिति से 45 डिग्री पर डाल दिया है और इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए असंभव हो जाएगा के रूप में सिरिंज भी अभी तक यह नीचे नहीं होना चाहिए। शीर्षस्थान पर सीधे सिरिंज ओरिएंट और फिर वांछित निर्देशांक का पता लगाने। प्वाइंट # 1: 0.5 मिमी व्याख्यान चबूतरे और 2.5 मिमी शीर्षस्थान के लिए सम्मान के साथ पार्श्व मोटर कोर्टेक्स निर्देशांक पर एक इंजेक्शन के लिए कर रहे हैं। प्वाइंट # 2: 1.34 मिमी व्याख्यान चबूतरे, शीर्षस्थान के लिए सम्मान के साथ 2.5 मिमी पार्श्व। निर्देशांक स्थित किया गया है एक बार, एक पतली टिप के साथ एक मार्कर के साथ खोपड़ी पर उनकी स्थिति का संकेत। सही समन्वय स्थापित छिपा हो सकता है अत्यधिक स्याही रिलीज के रूप में खोपड़ी में केवल एक डॉट बनाओ। ध्यान से 45 डिग्री पर ड्रिल पकड़े खोपड़ी ड्रिल। यह पूरी तरह से perf नहीं है कि इतनी 2.8 कदम के रूप में, अक्सर खोपड़ी की जांचड्रिल की वजह से मस्तिष्क को नुकसान से बचने के लिए orated। सभी हड्डी हटा दिया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक सिरिंज की नोक का प्रयोग करें। सिरिंज में पथ दरियाफ्त कमजोर पड़ने के 600 nl लोड करें। जानवर के सही पक्ष की ओर 45 डिग्री के लिए खड़ी स्थिति को समायोजित करें। माइक्रोस्कोप के तहत, सही छेद के सामने सिरिंज की सुई की नोक जगह है। 1.5 मिमी से खड़ी दिशा में यह कदम। दबाव इंजेक्शन करने से पहले 30 सेकंड मिनट के लिए 1 के लिए इस स्थिति में सुई स्थिर करते हैं। 30 सेकंड के द्वारा एक दूसरे से अलग 100 NL के तीन चरणों में दरियाफ्त कमजोर पड़ने के 300 nl इंजेक्षन। पिछले इंजेक्शन के बाद, दिमाग से बाहर करने के लिए प्रवाह दरियाफ्त से बचने के लिए 30 सेकंड मिनट के लिए 1 के लिए स्थिर सिरिंज छोड़ दें। धीरे धीरे, सिरिंज बाहर खींच दूसरे छेद पर यह स्थानांतरित करना और सिरिंज के अंदर हैं कि शेष 300 nl साथ ही इस प्रक्रिया को दोहराने। दूसरे इंजेक्शन के बाद, सिरिंज को हटाने और wou बंद करने के लिए आगे बढ़नाएन डी और 5-0 सीवन के साथ पीवीपी-मैं की कुछ बूँदें जोड़ें। एक नए पिंजरे में पशु ले जाएँ। क्या अभी भी संचालित नहीं किया गया है कि जानवरों के साथ संचालित जानवरों डाल नहीं। सर्जरी आया है कि पशु एक साथ रखा जा सकता है। वे जाग रहे हैं और स्टर्नल लेटना आ गया है जब तक पहुंच से बाहर चूहों मत छोड़ो। पशु बलि से पहले 10 दिनों के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें। 5. पथ अनुरेखक अवलोकन संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार पूरी तरह से पशु anesthetize। उंगलियों के साथ या एक संदंश के साथ जब दबाया hindpaw में उत्तर की कमी को देख कर संज्ञाहरण की पुष्टि करें। जानवर पूरी तरह से सो रहा है जब तक आगे बढ़ना नहीं है। मानक प्रोटोकॉल 6 के तहत पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएच 7) के साथ जानवरों छिड़कना। 4% paraformaldehyde में हे / एन विसर्जन से मस्तिष्क और बाद तय यह निकालें। दिमाग सिंक तक 30% पर सुक्रोज में दिमाग Cryoprotect। तब दिमाग हटाने और 10 सेकंड imme द्वारा उन्हें रोकतरल नाइट्रोजन में rsion। वर्गों का उत्पादन किया जाता है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर दिमाग रखें। एक cryostate पर सेक्शनिंग द्वारा प्रतिगामी पथ दरियाफ्त विश्लेषण के लिए और अग्रगामी पथ दरियाफ्त विश्लेषण के लिए 40 माइक्रोन से कम 20 माइक्रोन से कम वर्गों का उत्पादन। नोट: FG लेबल न्यूरॉन्स पराबैंगनी प्रकाश उत्तेजना के तहत सफेद कोशिकाओं के रूप में मनाया जा सकता है। बीडीए फाइबर 6.7 के विपरीत बढ़ाने के लिए एक avidin बायोटिन-peroxidase जटिल और 0.4% पर निकल के अलावा के साथ 3,3 'diaminobenzidine साथ हे / एन ऊष्मायन से पता चला है।

Representative Results

हम 3 दिनों के बाद शुरू होने वाले 30 दिनों के दौरान miniosmotic पंप (चित्रा 1, चित्रा 3) के माध्यम से सीधे मस्तिष्क में rhEpo को जन्म दिया तो एक छोड़ दिया स्ट्रिएटम में घाव और उत्प्रेरण intraluminal सीवन विधि द्वारा मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा के 30 मिनट के लिए पशुओं को प्रस्तुत स्ट्रोक 6। चित्रा 4 सीबी और बीडीए इंजेक्शन और ट्रेसर इंजेक्शन थे जहां क्षेत्र के बाद पता लगाया था कि कॉर्टिको रीढ़ की हड्डी में मार्ग की एक योजनाबद्ध दिखाता है। हम क्रमशः rhEpo प्रसव के 14 और 42 दिनों के बाद पकड़ शक्ति और मोटर प्रदर्शन (चित्रा 5) के एक सुधार दिखाया। बाएं स्ट्रिएटम पर एक स्ट्रोक प्राप्त किया है कि जानवरों की सही मोटर कोर्टेक्स में बीडीए की डिलिवरी, के रूप में फाइबर अंकुरण के सफल धुंधला का प्रदर्शन, लाल और चेहरे नाभिक के स्तर पर मध्य रेखा के पार मोटर तंतुओं में वृद्धि (चित्रा 5) से पता चला miniosmot साथ औषधीय उपचार का एक परिणामआईसी पंप। rhEpo उपचार भी, फैलाना astrocytosis देरी, neuronal अस्तित्व में वृद्धि हुई glial निशान गठन को कम किया है और अध्ययन की अवधि 6 में angiogenesis वृद्धि हुई है। पथ दरियाफ्त इंजेक्शन के लिए इसी तकनीक का उपयोग करके हम सफलतापूर्वक प्रतिगामी पथ दरियाफ्त FG के इंजेक्शन (चित्रा 6) द्वारा कोर्टेक्स से जुड़े हैं कि thalamic नाभिक पता लगा सकते हैं। चित्रा इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल miniosmotic पंप 1. अवयव। स्पेसर डिस्क, प्रवेशनी और हटाने योग्य टैब, कैथेटर, प्रवाह मध्यस्थ और miniosmotic पंप मनाया जा सकता है। पूरी तरह से इकट्ठे पंप के पहलू चित्रा 2A में देखा जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <p class="jove_content" fo:keep-together.w ithin-पेज = "1"> पंप आरोपण मुख्य बिंदुओं में से 2. सारांश चित्रा। यह करने के लिए अगले पूरी तरह से निर्माण miniosmotic पंप के साथ स्टीरियोटैक्टिक उपकरण पर रखा के रूप में (ए) माउस दिखाया गया है। तीर आरोपण के लिए चयनित निर्देशांक इंगित करता है। (बी) के पंप जानवर की पीठ पर शुरू की है और केवल प्रवेशनी बाहरी पर बनी हुई है किया गया है। आरोपण के बाद सिर की खोपड़ी पहले से ही drilled किया गया है। (सी) पहलू। (C-1) प्रवेशनी स्थिति पर है, लेकिन हटाने योग्य टैब में कटौती नहीं की गई है। (सी .2) हटाने योग्य टैब में कटौती और सिलाई की गई है घाव अब शुरू हो सकता है। (डी) तारांकन 30 दिनों के आरोपण (#) के बाद एक जानवर की तुलना में एक हाल ही में प्रत्यारोपित पशु से पता चलता है। सही ढंग से रखे जब छवि पर दिखाया गया है, घाव प्रक्रिया के अंत तक बंद रहना चाहिए।ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3. कोर्टेक्स पर आरोपण की साइट का संकेत Nissl धुंधला हो जाना। एक छोटा सा चीरा बाईं कोर्टेक्स (तीर) की ओर से मनाया जा सकता है। प्रवेश कर क्षेत्र की चौड़ाई लगभग 50 माइक्रोन है। इसी contralateral क्षेत्र (*) की तुलना में Nissl धुंधला के आधार पर कोई स्पष्ट गंभीर ऊतक परिवर्तन कर रहे हैं। आर: सही गोलार्द्ध। एल: बाएँ गोलार्द्ध। स्केल बार = 300 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4. पथReitmeier एट अल। 6.7 से पहले प्रकाशित रूप में दरियाफ्त इंजेक्शन रणनीति। (ए) सीबी जबकि contralateral मोटर कोर्टेक्स में पथ दरियाफ्त बीडीए के लिए योजनाबद्ध का संकेत इंजेक्शन साइटों infarcted गोलार्द्ध के मोटर कॉर्टेक्स में इंजेक्ट किया गया था। फाइबर दिखाया गया है लाल नाभिक (नहीं दिखाया गया है) और चेहरे नाभिक (चित्रा 5)। (ख) अगले मोटर कोर्टेक्स को अग्रगामी पथ दरियाफ्त बीडीए के इंजेक्शन साइट के लिए पीछा किया गया था। काला तीर बीडीए के साथ लेबल कुछ cortical कोशिकाओं से पता चलता है, जबकि सुई ट्रैक का संकेत लाल तीर ध्यान दें। CX: कॉर्टेक्स। सीसी: महासंयोजिका। वी: वेंट्रिकल। एफ एन: चेहरे नाभिक। बी में स्केल बार = 200 माइक्रोन। चित्रा -4 ए रज़ामंदी 6 के साथ reproduced है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <iमिलीग्राम alt = "चित्रा 5" src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 52,932 / 52932fig5.jpg" /> RhEpo की डिलीवरी के बाद एक infarcted मस्तिष्क की चित्रा 5. वसूली। (ए) बीडीए contralesional मोटर कॉर्टेक्स में इंजेक्ट किया तो चेहरे नाभिक का स्तर (शीर्षस्थान -5.8 मिमी के लिए -6.3 मिमी) पर corticobulbar फाइबर में पाया जाता है। प्रत्येक गोलार्द्ध पर चौराहे लाइनों midline और ipsilesional और contralesional गोलार्द्ध की दिशा में एक लाइन पार फाइबर के समानांतर तैयार थे गिना और corticospinal पथ में कुल लेबल तंतुओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया। साधन + Erythropoietin contralesional चेहरे नाभिक डेटा दिशा में फाइबर क्रॉसिंग वृद्धि हुई हैं – एसडी। डेटा कम से कम महत्वपूर्ण अंतर परीक्षण, §P <0.05 वाहन इलाज गैर इस्कीमिक चूहों के साथ तुलना में। (बी) मोटर व्यवहार रोटा रॉड परीक्षा में हाथ पकड़ शक्ति और समन्वय के लिए एक सुधार दिखाया द्वारा पीछा एक तरह से एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया। डेटा मतलब valu हैंतों + – एसडी। डेटा प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक तरह से एनोवा / कम से कम महत्वपूर्ण मतभेद परीक्षण के द्वारा पीछा किया, दो तरह से दोहराया उपायों एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया। §P <पूर्व इस्कीमिक आधारभूत के साथ तुलना में 0.05; * पी वाहन इलाज किया इस्कीमिक चूहों के साथ तुलना में 0.05 <। 5 ए और बी रज़ामंदी 6 के साथ प्रतिलिपि हैं आंकड़े। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 6. लक्ष्य संरचनाओं Fluorogold (FG) के इंजेक्शन के बाद पहुंच गया। (ए) मोटर प्रांतस्था करने के लिए अगले FG इंजेक्शन साइट चित्रा 1 में संकेत के रूप में। सुई ट्रैक और में कुछ लेबल की कोशिकाओं का संकेत सफेद तीर का संकेत लाल तीर नोट कोर्टेक्स। (बी) FG मोटर के पास इंजेक्टकोर्टेक्स VPL में पाया जाता है। फाई: fimbria। आईसी: आंतरिक कैप्सूल। आरटी: thalamic जालीदार नाभिक। VPL: thalamic उदर posterolateral नाभिक। स्केल बार = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

कई सालों के लिए, इस्कीमिक स्ट्रोक या घाव मस्तिष्क की चोट की तरह neurodegenerative शर्तों पर अनुसंधान तीव्र स्ट्रोक चरण में neuronal अस्तित्व को बढ़ावा देने के उद्देश्य है कि न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचारों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है। क्लिनिक में अनुवाद किया जब पाया गया है कि दवा के उपचारों के विशाल बहुमत में विफल रहा है कृंतक मॉडल में प्रभावी होने के लिए। इस चिकित्सकीय असफलता के कारणों में शामिल हैं लेकिन कार्यात्मक न्यूरोलॉजिकल वसूली बने, जिसके परिणामस्वरूप में निरंतर दवा के प्रभाव की कमी के कारण ही सीमित नहीं हैं। यह लंबी दौड़ में मस्तिष्क पुर्ननिर्माण को बढ़ावा देने के लिए रणनीति विकसित करने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है। Neuronal अस्तित्व को बढ़ावा देने के अकेले सफल स्ट्रोक वसूली की अनुमति देने के लिए पर्याप्त नहीं है, क्योंकि असफल neuroprotection परीक्षणों की बड़ी संख्या ने सुझाव दिया है, न्यूरोनल प्लास्टिसिटी की उत्तेजना हाल ही में इस क्षेत्र में प्रमुख ब्याज प्राप्त किया है।

दवा वितरण कर रहे हैं intraperitoneal इंजेक्शन, पूंछ intravascular मैं के लिए इसका मतलबnjection, ऊरु इंजेक्शन, एकल स्टीरियोटैक्टिक मस्तिष्क में वैक्टर के इंजेक्शन और miniosmotic पंपों द्वारा निरंतर वितरण जारी रखा। पंप एक प्रवेशनी नहीं है, या हम मस्तिष्क में प्रसव के लिए दिखाया गया है, अंग-निर्देशित किया जा सकता है, जो यदि उत्तरार्द्ध, प्रणालीगत प्रसव के शामिल कर सकते हैं। Miniosmotic पंप के अपवाद और वायरल वैक्टर के उपयोग के साथ, अन्य सभी रणनीतियों अस्थिर दवा सांद्रता प्रेरित करेगा। लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए यह इस प्रकार लगातार इंजेक्शन प्राप्त करने के तनाव को पशु प्रस्तुत करने के लिए आवश्यक हो जाता है। बीबीबी मस्तिष्क में चिकित्सीय सांद्रता को प्राप्त करने के क्रम में भारी प्रोटीन या दवा dosages की जरूरत होती है, जिसके परिणामस्वरूप रक्त से प्रोटीन या दवाओं के मस्तिष्क तेज के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा लगाता है। उदाहरण पेलेग्रिनी एट अल के लिए। 30 ग्राम (एक 300 ग्राम चूहे के लिए 750 आइयू / दिन) के एक पशु के लिए 75 आइयू / दिन के बराबर एक खुराक पर intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा rhEpo वितरित (2013) ^5। इसकी तुलना में, रामपुर जलविद्युत परियोजना की डिलीवरी को निशाना बनायामस्तिष्क के लिए ओ हमें 0.25 μl / घंटा की एक निश्चित दर पर एक बड़ा समय के पैमाने से अधिक वसूली लक्ष्य को हासिल करने के लिए हमें सक्षम है, जो सफल स्ट्रोक वसूली के लिए हमारे अध्ययन में केवल 10 आइयू / दिन की बहुत कम मात्रा का उपयोग करने की अनुमति दी।

इस काम में हम इस प्रकार बीबीबी circumventing, निलय में सीधे प्लास्टिसिटी को बढ़ावा देने प्रोटीन rhEpo देने के क्रम में खोपड़ी से जुड़ा एक प्रवेशनी साथ minipumps का आरोपण की विधि से पता चला है। इस विधि से, rhEpo रोधगलितांश आकार में कमी, glial निशान गठन की कमी और angiogenesis की प्रेरण सहित तरीकों की एक संख्या में न्यूरोलॉजिकल वसूली को बढ़ावा दिया। rhEpo भी neuronal अस्तित्व को बढ़ावा दिया और denervated लाल नाभिक और चेहरे नाभिक की ओर contralesional मोटर प्रांतस्था से अनुमानों में वृद्धि हुई। फाइबर के अंकुरण मोटर प्रांतस्था (आंकड़े -4 ए और 5 ए) में अग्रगामी पथ दरियाफ्त बीडीए के इंजेक्शन से पता चला था। फाइबर के अंकुरण के लिए एक कार्यात्मक सहसंबंधी पीआर हैमोटर कौशल में सुधार (चित्रा 5 ब) द्वारा ovided। इसके अतिरिक्त, हम पथ दरियाफ्त इंजेक्शन के लिए एक ही दृष्टिकोण प्रतिगामी पथ दरियाफ्त FG (चित्रा 6B) का इंजेक्शन द्वारा thalamo-cortical कनेक्शन अनावरण करने के लिए लागू किया जा सकता है कि पता चला है।

Miniosmotic पंप की तैयारी में, यह लक्ष्य बिंदु और spacers के इस्तेमाल पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम साथ, 0.9 मिमी पार्श्व, सुई की बहुत टिप दी निर्देशांक पर वेंट्रिकल के साथ संपर्क (-0.2 मिमी दुम में है इस तरह के रूप में 0.5 मिमी से 2.5 मिमी dorso उदर सुई की लंबाई कम करने के लिए एक स्पेसर का उपयोग शीर्षस्थान के संबंध में)। गहरे ढांचे अनुसंधान का लक्ष्य कर रहे हैं हालांकि, तो कोई स्पेसर की जरूरत होगी। एक अधिक बाहरी वितरण बिंदु वांछित है अगर इसी तरह, (यानी। कोर्टेक्स), तो अधिक स्पेसर डिस्क आवश्यक हो जाएगा। पंप सिर के करीब भी नहीं है कि इतना है कि यह समझौता ज्ञापन के आंदोलनों को रोकना होगा के रूप में कैथेटर, काफी लंबे समय होना चाहिएएसई, लेकिन यह भी नहीं भी लंबे समय के रूप में एक बार प्रत्यारोपित अत्यधिक लंबाई इस प्रकार माउस की प्राकृतिक आंदोलन द्वारा प्रवेशनी हटाने का खतरा बढ़ कैथेटर मोड़ करने के लिए कारण हो सकता है। कैथेटर के 2 सेमी का एक वर्ग गतिशीलता और प्रत्यारोपण की स्थिरता (आंकड़े 1 और 2) के मामले में बहुत अच्छा परिणाम देता है। 37 डिग्री सीओ / एन पर पंप के ऊष्मायन पंप तुरंत आरोपण के क्षण में मस्तिष्क में दवा पम्पिंग शुरू करने के लिए अनुमति देता है।

Miniosmotic पंप आरोपण में यह खोपड़ी ठीक से प्रवेशनी दाखिल करने से पहले सूख रहा है विश्वास दिलाता हूं कि महत्वपूर्ण है। आमतौर पर शुष्क करने के लिए हड्डी प्रेरित करेगा 70% इथेनॉल के साथ सफाई, लेकिन लगातार खून बह पाया जाता है, तो एक cauterizer के साथ धीरे खोपड़ी छू यह पूरी तरह से सूख जाएगा। यह सुई की शुरूआत के रूप में संभव के रूप में खड़ी है और धीमी है कि आश्वस्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। स्थिति में है, और गोंद सूख रहा है, जबकि एक बार, प्रवेशनी के शीर्ष पर उंगली रखकर ov बग़ल में जाने से रोकता हैखोपड़ी इंजी। विशेष देखभाल प्रवेशनी के घाव और प्लेसमेंट को दी जानी चाहिए। यह चीरा बिल्कुल खोपड़ी के बीच लाइन पर लेकिन थोड़ा सही पक्ष के अनुरूप प्रदर्शन नहीं कर रहा है कि महत्वपूर्ण है। घाव बंद करने के दौरान चीरा मध्य रेखा पर बनाया गया था, अगर त्वचा इस प्रकार घाव खोलने का खतरा बढ़ बोझ हो जाएगा। एक पक्ष को थोड़ा चीरा सीवन अंक प्रवेशनी के उच्चतम भाग से दूर होने की अनुमति होगी। एक परिणाम के रूप में वहाँ सिवनी अंक पर कम तनाव हो जाएगा और घाव ठीक से भर जाएगा। पशु अकेले बंदी और विशेष रूप से आरोपण के बाद पहले 10-15 दिनों के दौरान, हर दिन की जाँच की जानी चाहिए। घाव स्फुटन के मामले में, घावों को जल्द से जल्द बंद किया जा सकता है। प्रवेशनी हटा दिया जाता है या जानवर एक संक्रमण प्रस्तुत करता है, तो प्रयोग समाप्त हो गया है। प्रवेशनी की फिर से आरोपण की सिफारिश नहीं है। सफल प्रत्यारोपण ऊतक विज्ञापन के लिए पर्याप्त मात्रा में उपयोग करने के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण हैhesive (बहुत ज्यादा नहीं है!) यह हड्डी degrades और प्रवेशनी हटाने का खतरा बढ़ जाता है। हालांकि यह भी हड्डी से जुड़ी प्रवेशनी पकड़ नहीं होगा बहुत कम चिपकने का उपयोग। miniosmotic पंप विलायक biocompatible है कि इस के लिए केवल सीमा किया जा रहा है, पदार्थों की एक विस्तृत विविधता में भंग दवाओं ले जा सकता है। इसके अतिरिक्त, मात्रा छोटा है यह देखते हुए कि (200 μl) एक प्रयोग के लिए आवश्यक एकाग्रता उपयुक्त है या नहीं यह निर्धारित करना चाहिए और पंप के अंदर वर्षा के कारण नहीं होगा।

अग्रगामी या वक्री या तो ट्रेसर साथ अनुरेखण पथ मस्तिष्क कनेक्टिविटी और प्लास्टिसिटी अध्ययन करने के लिए एक बहुत अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है। एक अध्ययन करना चाहता है मस्तिष्क क्षेत्र को निशाना बनाने पर सटीकता सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन जब देखभाल का उपयोग स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम करने के लिए दिया जाना चाहिए (कोर्टेक्स इंजेक्शन जब यानी, महासंयोजिका पर इंजेक्शन रोकने के लिए)।

सभी शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के लिए और दर्द को कम करने के लिए औरसूजन, जानवरों के हस्तक्षेप के बाद तीन दिनों के लिए / किग्रा एक बार एक दिन में 4 मिलीग्राम पर हस्तक्षेप और Caprofen से पहले 0.1 मिलीग्राम / किलो buprenorphine साथ व्यवहार किया जाना चाहिए।

अंत में, इस दृष्टिकोण अच्छी तरह से मस्तिष्क plasticity पर अध्ययन के लिए अनुकूल है कि एक विधि का प्रतिनिधित्व करने, घायल मस्तिष्क में प्रोटीन या औषधीय यौगिकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उचित उपकरण प्रदान करता है।

Materials

Alzet miniosmotic pump. Model 2004.	Alzet	000298	Drug container
Brain infusion kit 3 1-3mm	Alzet	0008851	Drug brain delivery system
Loctite  454 Prism gel	Loctite	45404	Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull
75N glass syringe	Hamilton	87900/00	Injection of tract tracers
Biotin Dextran Amine (10000 MW)	Molecular probes	N-7167	Anterograde tract tracer
Fluorogold	Fluorochrome, LLC.		Retrograde tract tracer
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection.