Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

Summary

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Abstract

Los neutrófilos, la más abundante de todas las células blancas de la sangre en la circulación humana, juegan un papel importante en la defensa del huésped contra los microorganismos invasores. Además, los neutrófilos desempeñan un papel central en la vigilancia inmune de las células tumorales. Tienen la capacidad de reconocer las células tumorales e inducir la muerte de células tumorales, ya sea a través de un mecanismo dependiente del contacto celular que implica peróxido de hidrógeno o a través de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Los neutrófilos con actividad anti-tumor se pueden aislar a partir de sangre periférica de pacientes con cáncer y de ratones portadores de tumores. Estos neutrófilos se denominan neutrófilos tumorales arrastradas (diez) para distinguirlos de los neutrófilos de sujetos sanos o ratones naïve que no muestran actividad citotóxica significativa tumor. En comparación con otras células blancas de la sangre, los neutrófilos muestran diferente flotabilidad por lo que es factible obtener a> 98% de la población de neutrófilos puro cuando se somete a un gradiente de densidad. Sin embargo, ademása la población de neutrófilos de alta densidad normal (HDN), en pacientes con cáncer, en ratones portadores de tumores, así como en condiciones inflamatorias crónicas, las poblaciones de neutrófilos de baja densidad distintas (LDN) aparecen en la circulación. LDN co-purifica con la fracción mononuclear y se puede separar a partir de células mononucleares utilizando cualquiera de las estrategias de selección positivos o negativos. Una vez que la pureza de los neutrófilos aislados se determina por citometría de flujo, pueden ser utilizados para in vitro y en ensayos funcionales in vivo. Se describen técnicas para el seguimiento de la actividad anti-tumor de los neutrófilos, su capacidad para migrar y para producir especies reactivas del oxígeno, así como la supervisión de su capacidad fagocítica ex vivo. Describimos más técnicas para etiquetar los neutrófilos para el seguimiento in vivo, y para determinar su capacidad anti-metastásico in vivo. Todas estas técnicas son esenciales para la comprensión de cómo obtener y caracterizar los neutrófilos con anti-tumorfunción.

Introduction

Los neutrófilos se caracterizaron inicialmente como las células inmunes innatas que sirven como primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Hoy en día se sabe que los neutrófilos han más funciones de gran alcance, estar involucrado en el montaje de la respuesta inmune adaptativa contra antígenos extraños ^1,2, regulación de la hematopoyesis ^{3, 4} angiogénesis y cicatrización de heridas ^5. Además, los neutrófilos pueden afectar el crecimiento del tumor y la progresión metastásica en virtud de sus actividades pro- y anti-tumorales ^6,7. Los neutrófilos se caracterizan por un núcleo segmentado polimórfica (por lo tanto denominado polimorfonucleares (PMN) leucocitos) y contienen al menos tres subclases distintas de gránulos, así como vesículas secretoras ⁸ (Figura 1A-C).

Los neutrófilos poseen alta capacidad fagocítica y de alta actividad de la oxidasa NADPH crítico para la eliminación microbiana, y secretan una amplia gama de quimioquinas importantes por lotracción de los neutrófilos adicionales y otras células inmunes en el sitio de la inflamación ^8,9. Los neutrófilos se caracterizan por la expresión de una gran cantidad de receptores de la superficie, incluyendo los receptores de tipo Toll (TLRs), lectina tipo C receptores (CLR), receptor del complemento 3 (CD11b / CD18) y otras moléculas de adhesión (por ejemplo, L-selectina, LFA-1, VLA-4 y carcinoembrionario relacionados antígeno-molécula de adhesión celular 3 (CEACAM3 / CD66b)), receptores de quimiocinas (por ejemplo, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), los receptores quimioatrayentes (por ejemplo, PAFR, LTB ₄ y R C5aR) , receptores de citoquinas (por ejemplo, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-receptores de péptidos (por ejemplo, FPR1-3), y los receptores de Fc (por ejemplo, CD16 (Fc? RIII ), CD32 (RII) y CD64 (Fc? RI) ^10. En los ratones, los neutrófilos suelen identificarse como CD11b ⁺ Ly6G ^+, mientras que los neutrófilos humanos se identifican utilizando los marcadores de leucocitos CD11b, CD15, CD16 y CD66b. También es generalmente aceptado para teñir para la mieloperoxidasa proteínas granulares (MPO) y la elastasa de neutrófilos (NE) para la detección de los neutrófilos en los tejidos.

Aún no está claro si las diversas funciones de los neutrófilos están mediados por la misma célula o por sub-poblaciones de células distintas. La acumulación de datos sugieren la presencia de una población heterogénea de neutrófilos que exhibe un alto grado de plasticidad afectados por estímulos proinflamatorios y el microambiente ^11,12. Fridlender et al. ¹³ groseramente han dividido a los neutrófilos en el cáncer en dos grandes grupos de población denominado N1 con propiedades antitumorales y N2 con propiedades pro-tumorales. En el cáncer, así como en la inflamación crónica, existe una sub-población adicional compuesta de células granulocíticas mieloides derivadas de supresores (G-MDSCs) que suprimen las respuestas de células T ^14. G-MDSCs se considera que son las células mieloides inmaduras se caracterizan por un CD11b ⁺ Ly6C^{bajo hi} fenotipo Ly6G en ratones ^15, mientras que con un CD15 ⁺ / CD16 ^baja fenotipo en humanos ^16. G-MDSCs expresan niveles más altos de arginasa y la mieloperoxidasa, mientras que los niveles más bajos de citocinas y quimiocinas que los neutrófilos circulantes normales. Son menos de fagocitosis y migratoria, pero producen mayores niveles de ROS ^15,17,18. En el presente artículo vamos a describir algunas metodologías básicas para el aislamiento y la caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales.

Mientras que los neutrófilos constituyen la población más grande de todas las células blancas de la sangre en la circulación humana (45 – 70%; 1800 – 6000 / l), en ratones, en condiciones normales, son más bien escasa (10 – 15%; 300-500 / l ). El recuento de neutrófilos aumenta de manera constante sobre la inflamación y en ocasiones en el cáncer, lo que representa un estado de inflamación crónica ^7. Los neutrófilos se desarrollan a partir multipotentes precursor mieloide común (CMP) cells en la médula ósea, a través de un proceso de diferenciación que pasan las etapas de mieloblastos (MB), promielocitos (PM), mielocitos (MC), metamielocitos (MM) y células de la banda (BC) ^8. Los neutrófilos, post-mitóticas maduras pueden permanecer dentro de la médula ósea de 4-7 días antes de que se liberan a la circulación ^8. Facturación de neutrófilos en la sangre suele ser rápida con una vida media promedio de 6 – 12 horas, que puede ser prolongado en condiciones inflamatorias. Neutrófilos no estimulados han limitado la actividad anti-tumorigénicos, una característica que puede ser adquirida mediante la exposición de los neutrófilos ingenuos a las quimiocinas IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 y CXCL5 ^6,19 o artificialmente, al exponerlos a la forbol éster de forbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) ^6.

La corta vida media de los neutrófilos en la sangre junto con el bajo número de neutrófilos (~ 3-5 x 10 ⁵⁾ alcanzado entre el 1 ml de sangre de un inocente 6-8 semanas de edad ratón, han hechodifícil de explorar la función de los neutrófilos circulantes ratón in vitro. Para superar esta dificultad, se han utilizado otras fuentes. Por ejemplo, un gran número de neutrófilos pueden ser obtenidas de la médula ósea ²⁰ o el peritoneo tras la inducción de la inflamación estéril (por ejemplo, después de la inyección intraperitoneal de caldo de tioglicolato o Zymosan A). Cabe señalar que los neutrófilos obtenidos a partir de la cavidad peritoneal no ejercen ninguna actividad anti-tumorigénico (observación no publicada).

. Granot et al ⁶ observó que los ratones BALB / c inoculados ortotópicamente con el ratón 4T1 línea celular de carcinoma de mama desarrollar neutrofilia que agrava con la progresión tumoral ⁶ (Figura 2A), de tal manera que 20 a 40000000 neutrófilos de la sangre pueden ser fácilmente aislados de 1 ml de sangre 3 – 4 weeks post-inoculación del tumor. Estos neutrófilos han adquirido las actividades antitumorales, y en consecuencia han sido coineutrófilos nidos tumorales arrastradas (RTE), a fin de distinguirlos de los neutrófilos ingenuos ⁶ (Figura 2B). Mientras que los neutrófilos de alta densidad (HDN, la Figura 1A) son altamente anti-tumorigénicos, los neutrófilos de baja densidad (LDN, Figura 1B) generados en el contexto de cáncer no son ^21. Además, los neutrófilos de alta densidad de la médula ósea y el bazo de ratones portadores de tumores tienen actividad anti-tumor (datos no publicados). Cabe señalar que con la progresión del tumor del bazo se vuelve gradualmente agrandada (esplenomegalia), con cantidades crecientes de neutrófilos.

Cabe señalar que la RTE se generan también en otros modelos de cáncer incluyendo tanto espontáneas (MMTV-PYMT y MMTV-Wnt1 tumores mamarios y tumores de pulmón impulsados ​​k-Ras) y se inyectaron (AT-3 (MMTV-PYMT) y carcinoma de mama E0771 células, células de carcinoma de pulmón de Lewis LLC y células de melanoma B16-F10). Sin embargo, la medida de la movilización de neutrófilos en estos tumo modelos es mucho menor que los ratones inoculados-4T1, alcanzando 5-10 x 10 ⁶ neutrófilos en 1 ml de sangre después de 3 semanas.

Protocol

Animales: 5-7 semanas de edad BALB / c ratones se adquirieron de Harlan (Israel). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por Cuidado y Uso Institucional Comité de Animales de la Universidad Hebrea (IACUC). Muestras de humanos: Colección de sangre de pacientes con cáncer y voluntarios sanos fue aprobado por Hadassah Center Institucional Junta de Revisión Médica (IRB). 1. Inducción de neutrófilos con propiedades anti-tumorales in vivo utilizando un modelo de ratón …

Representative Results

En un estudio reciente se identificó una función anti-metastásica de neutrófilos 6. Los neutrófilos de ratones portadores de tumores adquirir un fenotipo citotóxico y tienen la capacidad para matar las células tumorales 6. Esto está en contraste con los neutrófilos de ratones naïve que no tienen efecto anti-tumoral significativa 6. Varias de las técnicas descritas en la Sección de Protocolo se han utilizado para el estudio de la función de neutrófilos anti-tumor in vitr…

Discussion

Los neutrófilos son las más abundantes de todas las células blancas de la sangre y son los primeros en responder en casos de infección y la inflamación. Como tales, son muy sensibles a las señales externas y se activan fácilmente. Además, los neutrófilos tienen una vida media muy corta y una rápida rotación. En conjunto, estas características plantean varias dificultades en el trabajo con los neutrófilos, de tal manera que se requieren estrategias experimentales únicas. Por ejemplo, hay varias estrategias …

Materials

CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells	ADCC	CRL-2539	Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate	Falcon	353047	Sterile
100 mm Tissue Culture Plate	Corning	430167	Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask	Nunc	156340	Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Sterile
Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube	Becton Dickinson	352058	Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate	Costar	3917	Sterile
Cell Strainer (40 mm)	BD Falcon	352340	Sterile
20G 1.5" Needle	BD Microlance 3	301300	Sterile
23G 1" Needle	BD Microlance 4	300800	Sterile
25Gx5/8" Needle	BD Microlance 5	300600	Sterile
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Sterile
9 mm Clips	BD, AutoClip	427631	Sterile
EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS Separation Column	Miltenyi Biotech	130-042-201	Sterile
MidiMACS Separator Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Microscope Glass Slide	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
Orbital Shaker	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
Plate Reader	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Sigma	A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)	Molecular Probes	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S8032	Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium	Life Technologies	31985062	Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Sigma	F9665	Sterile
L-Glutamine	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	Sterile
Sodium pyruvate	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Sterile
Penicillin Streptomycin x1000 solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	Sterile
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Sterile
HPLC grade water	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium	Life Technologies	A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS			Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO			Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution	Sigma	HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS			Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5	Promega	E153A	Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution	Promega	E1501	Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution	Sigma	MHS-32
PBS+0.5% BSA			Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS+1% BSA			Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA			Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water                     and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3)			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl)			Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution			Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution			Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide			Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution			Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	Sterile
1 mg/ml Zymosan A			Resuspend 1 mg Zymosan A  in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube.                            Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave.            Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE selection cocktail	STEMCELL Technologies	18151
the EasySep magnetic nanoparticles	STEMCELL Technologies	18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19257
FITC BrdU flow kit	BD Pharmingen	559619
MACS Neutrophil isolation kit	Miltenyi Biotec	130-097-658
Phagocytosis Assay Kit	Cayman Chemical Company	500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody	Biolegend	101302
Purified rat anti-Ly6G antibody	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody	Biolegend	127608	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11