مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D
Summary
Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.
Abstract
The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.
Introduction
حركة يفضل الخلايا نحو الانحدار تركيز، والمعروفة باسم الكيميائي، تلعب دورا هاما في العمليات المرضية والفسيولوجية في الجسم. هذه الأمثلة هي الجلد والغشاء المخاطي التئام الجروح 1، 2 التشكل، التهاب 3، و4،5 نمو الورم. وقد تبين أيضا أن الخلايا السرطانية يمكن أن تهاجر من خلال استراتيجيات كل من الخلية الهجرة الفردية والجماعية 6. وعلاوة على ذلك، يمكن لآليات عدم الاستقرار الأنتشارى لحث على فصل الخلايا واحد أو عنقودية من الجسم ورمي / الكائن ومن ثم يمكن أن يهاجر نحو مصدر من المواد الغذائية، وبالتالي غزو المناطق والأنسجة 7 أوسع.
وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن آليات الهجرة المتنوعة يمكن أن تكون نشطة في 2D و 3D في، وذلك بسبب الأدوار المختلفة للجزيئات الالتصاق 8. لذلك، خطوة إلى أهمية من الناحية الفسيولوجية في فحوصات المختبر للتحقيق في الحركة خلية في measureablه وسيلة بسيطة غير ذات أهمية في فهم حركة الخلية الظواهر 9. لسوء الحظ، وصعوبة في تحليل الهجرة الخليوي، وفحص شامل الكيميائي الكمي وعادة ما يتطلب طريقة شاقة طويلة، تقوم على قياس حركية الخلية والظواهر النقل نماذج محايدة.
وتشمل النهج التجريبية الماضية للتحقيق الكيميائي خلية الغرفة بويدن 10 وتحت الفحص الاغاروز 11. ومع ذلك، في هذه المقايسات في وقت مبكر، والتجارب الهجرة الخلية لم ترصد الحركة في احترام لآخر. أكثر من ذلك، الأهم من ذلك، التدرجات تركيز المستخدمة في التجارب لم تكن واضحة المعالم أو مفهومة تماما مع الحفاظ فقط إشارات لمدة لا تتجاوز بضع ساعة. وعلاوة على ذلك، الكيميائي في وقت مبكر محاولات غرفة تقييد الهجرة الخلية على بعدين، ولم تسمح لأحد لمراقبة حركية الهجرة 12. أبحث في غرفة بويدن، وهو فحص نقطة النهايةلن يسمح للباحث لمراقبة الهجرة بصريا، ولا يمكن التفريق مباشرة الكيميائي (حركة الاتجاه) من تنشيط كيميائي (حركة عشوائية). بالإضافة إلى ذلك، العديد من المتغيرات على الاختلافات في حجم المسام وسمك الأغشية جعل غرفة صعبة للغاية لتتكاثر بسهولة وأخفى رد فعل المهاجرين من الخلايا لكيموكينات 13،14.
مع الفهم الجديد من على microfluidics، وقد تم التحقيق غرف جديدة والأجهزة الدقيقة كأداة لتحقيق تنقل الخلية تحت ظروف تدفق فراغي أو الكيميائي 15،16. في ظل هذه الأجهزة الجديدة، أدخلت مقاييس خلية جديدة والتحقيق، مثل تأثير إجهاد القص على خلية 17،18. للأسف، غرف الكيميائي ميكروفلويديك السابقة والحالية دراسات الهجرة خلية تقتصر على ركائز و2D نكسة مهمة لأن العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك غزو الخلايا السرطانية وورم خبيث، والتراسل الفوريهجرة الخلايا المناعية، تنطوي الهجرة 3D.
حل جاذب كيميائي في اتصال مع هلام 3D التي تحتوي على الخلايا كما تم ذكر فيها غرف للمراقبة المباشرة أيضا 19،20. هذه الدوائر واثنين من مقصورات، واحدة تحتوي على جاذب كيميائي واحدة تحتوي على الخلايا، وانضم بجانب بعضها البعض أفقيا 21 أو حلقات متحدة المركز 22. وأشار هذه النظم في الاتجاه الصحيح، ولكن لا تبقي نظام الكيميائي لفترة طويلة من الزمن.
وعلاوة على ذلك، درس الباحثون أيضا انتشارية من خلال الأغشية الكولاجين في خلايا غسيل الكلى، فضلا عن انتشار جزيئات التتبع من خلال عينات الكولاجين تعرض لضغط الهيدروستاتيكي 23-25. بعض التجارب نشر في المواد الهلامية الكولاجين تعتمد على التعديلات الفيزيائية والكيميائية للالجل باستخدام المجالات المغناطيسية والتأسيس الكيماوية 26. وهناك طريقة شعبية لنمذجة الانتشارية في أعناقالأنسجة genous تعتمد على التصوير مضان المستمر نقطة photobleaching من. وقد كشفت هذه الطريقة تباين في معاملات نشر من الجزيئات في الأنسجة الكولاجينية المنحى. بعد، وقد استخدمت photobleaching من في الغضروف المفصلي وليس الكولاجين المصفوفات. في حين ما شابه ذلك، يجب أن تتم التجارب النمذجة اللازمة من خلال فهم على وجه التحديد معامل انتشار المواد الهلامية الكولاجين. الأهم من ذلك أن الأنظمة لا تستخدم وسيلة لقياس الجيل قوة الخلية.
للأسف، يبدو أن معظم الأنظمة ليكون في عداد المفقودين واحد أو اثنين من العناصر الرئيسية للنظام مثالي: والسماح للتتبع الخلية، فهم نشرها التدرج مع عامل الكيميائي من خلال مصفوفة، مجموعة بسيطة نسبيا حتى مع سهولة استنساخ، والتقليل من التفاعلات خلية خلية، والقدرة على قياس وحدة الأبعاد لالكمي (أي السرعة، القوة، وتركيز معين). Moghe وآخرون. </eم> 27 اقترح نظاما الوفاء معظم هذه المتطلبات في الخلايا التي فرقت البداية في جميع أنحاء هلام بدلا من ركز على سطح المرشح، ولكن كان من الصعب قياس القوى التي تولد الخلية.
لهذا الغرض، نقدم نظام مستو التدرج نشرها للتحقيق الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D، الذي يسمح احد للتغلب على القيود غرفة نشر الحديثة للفحوصات الحالية، التي تقوم على أساس الوقت الفاصل بين المجهري، إلى جانب تقنيات تحليل الصور لقياس الخلية القوات في بيئة 3D. يوفر هذا البروتوكول وسيلة بسيطة، لكنها مبتكرة لخلق 3D بسيطة نشرها الغرفة التي يمكن استخدامها لتحقيق الكيميائي 3D في خلايا مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية للتجارب الناجحة نشر مع أو بدون الخلايا هي: إعداد بشكل صحيح تصل الجمعية العفن. تطوير ما يلزم من البراعة اليدوية لمنع الضرر أثناء استخراج coverslips مسعور. ضمان للعثور على خط الانطلاق خطي جيد جدا لحساب معامل الانتشار بشكل صحيح؛ تصحيح الحسابات التجريبية…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.
Materials
| Silicone elastomer kit | Dow Corning Corp | 182 SIL ELAST KIT .5KG | a two-part misture with a 10:1 mix |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | CMB for 18mm round coverslips |
| 22mm Glass Coverslip | Fisher Scientific | NC0180281 | Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5 |
| Machined aluminum metal cube | |||
| Hobby utility knife | X-Acto | X3201 | |
| 3-(aminopropyl) trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778-5ML | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc | 00216A-10 | Glutaraldehyde, EM Grade, 8% |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Standard floor model and tabletop centrifuges |
| Glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm) |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327-379 | Fine Point Forceps |
| Cover glasses | Fisher Scientific | 12-518-105A | Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1 |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl | Gelest | SIT8174.0 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Acetic acid ACS reagent, ≥99.7% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | Hexane |
| anhydrous, 95% | |||
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| High-precision diamond scribing tool | Lunzer | PV-081-3 | Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length |
| Vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5C | High-Vacuum Grease |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface |
| 10X phosphate buffered solution | Fisher Scientific | BP399-500 | 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer |
| 1N sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 38215 | Sodium hydroxide concentrate |
| Collagen I, rat tail | BD Biosciences | 354236 | Rat tail |
| Micro centrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-332 | Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped |
| Carboxylate-modified microspheres | Invitrogen | F-8813 | Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich | 83689 | Rhodamine B for fluorescence |
References
- Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225 (2), 236 (1997).
- Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).
- Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).
- Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).
- Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).
- Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell’s sense of direction. Science. 284 (5415), 765-770 (1999).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).
- Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).
- Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).
- Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).
- Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).
- Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).
- Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).
- Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. d. L. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).
- Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).
- Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).
- Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
- Stephenson, F. H. . Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , (2010).
- Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
- Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).
- Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).
