3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム
Summary
Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.
Abstract
The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.
Introduction
走化性として知られている濃度勾配に向かう細胞の好ましい運動は、体内の病理学的および生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。このような例は、皮膚および粘膜創傷治癒1、形態形成2、3、炎症、および腫瘍増殖4,5です。また、癌細胞の両方の個々と集合細胞遊走戦略6を通って移動することができることが示されています。また、拡散不安定機構は腫瘍体/オブジェクトから単一またはクラスタ化された細胞の分離を誘導することができ、その後、栄養源に向かって移住し、したがって、より広い領域や組織7に侵入することができます。
また、多様な移動機構が原因で接着分子8の異なる役割に、2Dおよび3Dで活性であることが示されています。 measureablで細胞の運動性を調査するin vitroアッセイにおける生理学的に関連するので、移動e及び簡単な方法は、細胞運動現象9の理解に重要です。残念ながら、細胞の移動を分析することの困難は、総合的な定量化可能な走化性アッセイは、通常、公平な細胞の運動性と輸送現象モデルの測定に設立され、長い骨の折れる方法を、必要とします。
細胞走化性を調査する過去の実験的アプローチは、Boydenチャンバー10と下のアガロースアッセイ11を含みます。しかし、これらの初期のアッセイ内で、細胞遊走実験は、時間に対しての動きを監視していませんでした。もっと、重要なのは、実験に用いた濃度勾配が十分に定義されていないか、わずか数時間を超えないためのシグナリングを維持しつつ、完全に理解しました。また、初期の走化性チャンバーの試みは2次元に細胞移動を制限し、1つは、移行12の動態を監視することはできませんでした。 Boydenチャンバーを見ると、エンドポイントアッセイ研究者が視覚的に移行を観察することができず、直接ケモキネシス（ランダム移動）から走化性（方向性）を区別することができませんでした。また、孔径、厚さ、いくつかの変数の違いを容易に再現することは非常に困難チャンバ膜が製およびケモカイン13,14への細胞の移住反応を隠し。
マイクロフルイディクスの新しい理解して、新しいチャンバ及びマイクロデバイスは、間質流動条件または走化性15,16の下のセルの移動を調査する手段として研究されてきました。これらの新しいデバイスの下では、新しいセルのメトリクスを導入し、細胞17,18のせん断応力の影響のように、調査しました。残念ながら、過去と現在のマイクロ流体走化性チャンバー2D基板 – 腫瘍細胞の浸潤や転移を含む多くの生物学的プロセス、以来重要な後退に細胞移動の研究を制限され、イム胸細胞の移動は、3D移動を伴います。
直接観察室、化学誘引物質溶液が細胞を含む三次元ゲルと接触しても、また19,20が報告されています。これらのチャンバは、2つの区画、化学誘引物質および細胞を含むいずれかを含むものを持って、互いに水平方向に21または同心円状のリング22と横に結合されています。これらのシステムは、正しい方向に指摘されているが、長期間走化性システムを保持しません。
さらに、研究者はまた、透析細胞、ならびに静水圧23〜25にかけコラーゲンサンプルを介してトレーサー分子の拡散にコラーゲン膜を通した拡散性を検討しました。コラーゲンゲルの一部の拡散実験は、磁場および化学取込み26を用いたゲルの物理的および化学的修飾に依存しています。コーラで拡散をモデル化するための一般的な方法genous組織が連続点光退色の蛍光イメージングに依存しています。この方法は、指向膠原組織における高分子の拡散係数に異方性を明らかにしました。しかし、光退色は、関節軟骨ではなく、コラーゲンマトリックス中で使用されています。類似の間、必要なモデリング実験は、具体的にコラーゲンゲルの拡散係数を理解することを通して実施しなければなりません。さらに重要なことに、システムは、セル力発生を測定するための方法を利用しません。
マトリックスを通して細胞トラッキング、走化性因子と拡散勾配の理解を可能にする、再現性の容易さと、比較的簡単なセットアップ、の最小化：残念ながら、ほとんどのシステムでは、理想的なシステム用に1つまたは2つの重要な要素が欠けているように見えます細胞-細胞相互作用、および定量化のための寸法の単位を測定する能力（ 例えば 、速度、力、特定の濃度）。 Moghe ら。 </eM> 図27は 、細胞を最初にゲル全体に分散よりもむしろフィルタ表面に濃縮されたこれらの要件のほとんどを満たしシステムを提案したが、セルが生成する力を測定することは困難でした。
この目的のために、我々は細胞を測定するために、画像解析技術を用いて結合された1つは、タイムラプス顕微鏡検査に基づいて、既存のアッセイの現代の拡散室の制限を克服することを可能にする3次元コラーゲンマトリックスに走化性を調査する平面勾配拡散システムを提示します3D環境の力。このプロトコルは、異なるセル内の3D走化性を研究するために使用することができる単純な3D拡散室を作成するシンプルで革新的な方法を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞の有無にかかわらず成功した拡散実験のための最も重要な手順は次のとおりです。正しくモールドアセンブリを設定します。疎水性のカバーガラスの抽出時の損傷を防止するために必要な手先の器用さを開発します。正しく拡散係数を算出するための非常に良好な直線スタートラインを見つけることを保証します。コラーゲンと化学誘引物質の両方の実験的な計算を修正。正しく乾燥し?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.
Materials
| Silicone elastomer kit | Dow Corning Corp | 182 SIL ELAST KIT .5KG | a two-part misture with a 10:1 mix |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | CMB for 18mm round coverslips |
| 22mm Glass Coverslip | Fisher Scientific | NC0180281 | Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5 |
| Machined aluminum metal cube | |||
| Hobby utility knife | X-Acto | X3201 | |
| 3-(aminopropyl) trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778-5ML | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc | 00216A-10 | Glutaraldehyde, EM Grade, 8% |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Standard floor model and tabletop centrifuges |
| Glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm) |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327-379 | Fine Point Forceps |
| Cover glasses | Fisher Scientific | 12-518-105A | Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1 |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl | Gelest | SIT8174.0 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Acetic acid ACS reagent, ≥99.7% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | Hexane |
| anhydrous, 95% | |||
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| High-precision diamond scribing tool | Lunzer | PV-081-3 | Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length |
| Vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5C | High-Vacuum Grease |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface |
| 10X phosphate buffered solution | Fisher Scientific | BP399-500 | 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer |
| 1N sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 38215 | Sodium hydroxide concentrate |
| Collagen I, rat tail | BD Biosciences | 354236 | Rat tail |
| Micro centrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-332 | Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped |
| Carboxylate-modified microspheres | Invitrogen | F-8813 | Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich | 83689 | Rhodamine B for fluorescence |
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