Een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de Cel Mechanosensing en Durotaxis<em> In Vitro</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
De samenstelling en de mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix sterk uiteen weefseltypen. Dit bindweefsel stroma diversiteit grote invloed cel gedrag normaal en pathologische processen, waaronder proliferatie, differentiatie, hechting signalering en directionele migratie te reguleren. In dit verband, het aangeboren vermogen van bepaalde celtypen migreren naar een stijver of minder compatibele matrix substraat wordt genoemd durotaxis. Dit fenomeen speelt een belangrijke rol tijdens de embryonale ontwikkeling, wondgenezing en kankercel invasie. We beschrijven hier een eenvoudige test om durotaxis studie, in vitro, met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten. Bereiding van de beschreven durotaxis kamers creëert een stijfheid interface tussen de relatief zachte gel PDMS en een stijf glazen dekglaasje. In het voorbeeld hebben we deze durotaxis kamers gebruikt om een rol voor de Cdc42 tonen / Rac1 GTPase activerende protein, cdGAP in mechanosensing en durotaxis regelgeving in menselijke U2OS osteosarcoomcellen. Deze test is gemakkelijk aan te passen aan andere typen cellen en / of knock-down van andere eiwitten van de belangen van hun respectieve rollen verkennen in mechanosignaling en durotaxis.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) bestaat uit een complexe reeks van structurele en verknopen van proteïnen zoals collageen, fibronectine en laminine. Hoewel het goed is vastgesteld dat de ECM levert belangrijke structurele steun voor cellulaire weefsels, is er steeds meer bewijs om aan te geven dat cellen actief inspelen op de fysieke veranderingen in hun ECM-omgeving om diverse cellulaire processen zoals overleving van de cel, differentiatie en celmigratie reguleren. Zo kunnen verschillen in stijfheid van de ECM mesenchymale stamcellen rijdt richting verschillende geslachten, met zachte substraten (~ 1 kPa) bevordering neurogene lineages terwijl stijve (~ 25 kPa) substraten te bevorderen osteogene differentiatie 1. Ook is een toename van de stromale matrix stijfheid aangetoond mammaire epitheelcellen tumorigenese en invasie in het omringende weefsel 2,3 promoten.
Een bijzonder interessant aspect van deze mechanosignaling activiteit leidt tot een proces dat durotaxis, waarbij cellen preferentieel migreren naar een stijver substraat 4,5. Cellen constant zin de fysische eigenschappen van de extracellulaire omgeving via integrine receptor binding aan de ECM. Dit bevordert op zijn beurt de ophoping van talrijke structurele en signaaleiwitten hun cytoplasmatische domeinen van de vorming van lijm structuren bekend als focale adhesies of focale contacten 6,7 drijven. Omdat integrinen zijn geen inherente enzymatische activiteit worden signalen doorgegeven vanuit het ECM door deze additionele eiwitten de reactie van de cel om hun veranderende omgeving 8 coördineren. Dienovereenkomstig is de identificatie en karakterisering van de belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij het reguleren mechanosignaling en durotaxis is een belangrijk onderzoeksgebied.
Verschillende modelsystemen ontwikkeld studeren durotaxis in vitro, maar de meeste hebbengebruikt met collageen beklede substraten polyacrylamide 4. Echter, de bereiding van de polyacrylamide substraten technische uitdaging en collageen die in deze testen moeten chemisch verknoopt aan het substraat 9 zijn. Polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten bleken vergelijkbare mechanische eigenschappen vertonen om de substraten 10 polyacrylamide. Echter PDMS substraten bereid door eenvoudig mengen van een verhouding van de base om verknopingsmiddel en deze substraten kunnen worden bekleed met ECM eiwitten zonder chemische verknoping, waardoor PDMS makkelijker instrument om de effecten van starheid celgedrag bestuderen. Hierin beschrijven we hoe een eenvoudige durotaxis kamer waarin een zachte PDMS substraat is geïntegreerd met een stijve glazen dekglaasje bereiden.
De test, zoals hieronder wordt uiteengezet, verschaft een snelle en eenvoudige methode om durotaxis bestuderen. Voor deze studie gebruikten we de menselijke U2OS osteosarcoomcellen gecombineerd met siRNA-gemedieerdeknockdown van cdGAP om de rol van deze focale adhesie eiwit bestuderen durotaxis 11. Belangrijk is, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast aan de individuele behoeften. Andere celtypen kunnen worden gesubstitueerd voor de U2OS cellen en elk eiwit kan worden neergeslagen of overexpressie gebracht om de effecten op celgedrag tijdens durotaxis bepalen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan fluorescent gemerkte eiwitten te nemen om hun dynamiek en gedrag met behulp van FRAP of FRET benaderingen te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin beschrijven we een eenvoudige test om durotaxis bestuderen migrerende cellen. Een grote kracht van deze test is het gemak van de voorbereiding van de durotaxis kamers met behulp van PDMS. De stijfheid van de substraten kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door de verhouding van PDMS base oplossing verknopingsmiddel voor de studie van diverse starheid in de test toe. Echter, een mogelijke beperking van het systeem is dat cellen alleen worden blootgesteld aan een enkele verandering in substraat stijfheid tegenst…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIH R01 GM47607, CA163296 en NSF 1.334.493 te CET. Wij danken de leden van de Turner lab voor kritische lezing van het manuscript. Alle in dit rapport gegevens werden overgenomen met toestemming van Wormer et al. 2014 11.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
