Kvantificering af Cytosolisk vs. vakuolær<em> Salmonella</em> I Primære Makrofager af Differential Permeabilisering
Summary
We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Abstract
Intracellulære bakterielle patogener kan replikere i cytosolen eller i specialiserede patogen-holdige vakuoler (PCVs). For at nå cytosolen, bakterier som Shigella flexneri og Francisella novicida nødt til at inducere brud på fagosomet. I modsætning hertil Salmonella typhimurium replikerer i en vakuolær rum, kendt som Salmonella holdig vacuole (SCV). Men visse mutanter af Salmonella undlader at opretholde SCV integritet og således frigives i cytosolen. Procentdelen af cytosolisk vs. vakuolære bakterier på niveauet af enkelte bakterier kan måles ved differentiel permeabilisering, også kendt som fagosom-beskyttelse assay. Tilgangen gør brug af ejendommen vaskemiddel digitonin til selektivt at binde kolesterol. Da plasmamembranen indeholder mere kolesterol end andre cellulære membraner, kan digitonin anvendes til selektivt permeabilisere plasmamembranen mens intracellulære membranerintakt. Kort fortalt, efter infektion med patogenet udtrykker et fluorescerende markør-protein (f.eks mCherry blandt andre), er plasmamembranen af værtsceller permeabiliseret med en kort inkubering i digitonin buffer. Cellerne vaskes derefter og inkuberes med et primært antistof (koblet til en fluorophor valg) rettet mod bakterien valg (f.eks anti Salmonella FITC) og vasket igen. Hvis der anvendes umarkerede bakterier, kan et yderligere trin ske, ved hvilken alle membraner permeabiliseret og alle bakterier farves med et tilsvarende antistof. Efter farvningen, kan procentdelen af vakuolære og cytosoliske bakterier kvantificeres ved FACS eller mikroskopi ved at tælle enkelt eller dobbelt-positive begivenheder. Her giver vi eksperimentelle oplysninger om brug af denne teknik med bakterien Salmonella typhimurium. Fordelen ved dette assay er, at i modsætning til andre assay, giver det en kvantificering af niveauet af enkelt bacteria, og hvis analyseres ved mikroskopi giver det nøjagtige antal cytosolisk og vakuolære bakterier i en given celle.
Introduction
Intracellulære bakterielle patogener replikere enten direkte i værtscellen cytosolen eller i specialiserede vakuolære rum 1. I den indledende fase af infektionen fleste patogener bliver internaliseret enten ved fagocytose af specialiserede celler (såsom makrofager) eller ved aktivt at fremme deres egen optagelse i ikke-fagocytiske celler. I fagocytiske celler, normalt fagosomet sikringer med lysosomer til dannelse af en nedbrydende rum, hvor fagocyterede partikler fordøjes. Specialiserede cytosoliske bakterier, såsom Francisella novicida eller Shigella flexneri, flugt phagosomal nedbrydning ved at inducere brud på fagosomet og efterfølgende slipper ud i cytosolen 2,3. Dette kræver virulens-associerede mekanisme som Francisella patogenicitetsindeks Island (FPI) eller Shigella flexneri T3SS, som tilfører effektor proteiner, der fremmer vakuolær brud 2-4. Værtscellen cytosol funktioneret antal konserverede mønstergenkendelse receptorer, der normalt genkender tilstedeværelsen af patogener og inducerer medfødte immunreaktion signalering 5. Derudover xenophagy, kan en antimikrobiel form af autophagy nedbryde bakterier, der kommer ind i cytosolen. Cytosoliske bakterier er normalt godt tilpasset til sløve eller omgå disse svar ved hjælp af forskellige strategier. F.eks Francisella ændrer sine LPS at undgå vært anerkendelse og Shigella forhindrer autophagy rekruttering hjælp secernerede effektorproteiner 6,7.
En anden strategi for at undslippe lysosomal nedbrydning er ansat af modellen vakuolær patogen Salmonella enterica serovar Typhimurium, herefter benævnt Salmonella typhimurium. Salmonella bruger en T3SS at injicere effektorer, der remodel den indledende fagosom i sin intracellulære niche, Salmonella -indeholdende vakuolen (SCV) 8,9. Kontinuerlig manipulation af værten pathways ernødvendigt at opretholde denne vacuole ved at rekruttere lipider og andre næringsstoffer til vacuolen. Faktisk en SIFA mutant af Salmonella ikke bibeholder vakuolær stabilitet, og kommer ind i cytosolen af værtsceller inden for timer efter infektion, hvilket resulterer i aktivering af medfødte immune veje og autophagy rekruttering 8. Vakuolær udslip af Salmonella varierer afhængigt af celletype, der er undersøgelser, og flere rapporter har vist, at selv WT Salmonella i epitelceller kan undslippe SCV og hyperreplicate i cytosolen 10. Nylige rapporter viser, at medfødte immunforsvar påvisning af vakuolære patogener afhænger også af evnen af værten til at genkende og destabilisere patogen-holdige vakuoler (PCVs) 11-14.
Eftersom både værten eller bakterier genotype kan påvirke fordelingen af intracellulære bakterier mellem vakuolær og cytosoliske rum, er det nødvendigt at kvantificere antallet af vakuolær vs.cytosoliske bakterier. Da det i de fleste forsøgsopstillinger værtsceller inficeret med mere end én bakterie, og efterfølgende kan harbor flere bakterier i forskellige subcellulære afsnit er der behov for en teknik, der muliggør kvantificering af niveauet af enkelte bakterier. Differential permeabilisering (også kendt som phagosomal beskyttelse assay) giver denne beslutning 2,4,10,12. Bestemmelsen er baseret på selektiv permeabilisering af værtscellen plasmamembranen med detergent digitonin, som efterlader vakuolære membraner intakt og tillader således selektiv farvning af cytosoliske bakterier med antistoffer. Her giver vi to protokoller til kvantificering af cytosolisk og vakuolær Salmonella typhimurium ved hjælp af forskellen permeabilisering. Princippet i denne metode er beskrevet i figur 1: knoglemarv afledte makrofager (BMDMs) inficeres med stationær fase mCherry-udtrykkende Salmonella. Stationær fase Salmonella brug to anvendes, fordi de nedregulerer ekspressionen af SPI-1 T3SS, hvis aktivitet ellers ville blive anerkendt af NLRC4 inflammasome og inducere hurtig celledød (pyroptosis) i BMDMs 15. Efter infektionen celler vaskes og behandles med 50 ug / ml digitonin i 1 minut. Celler vaskes straks igen og inkuberet med anti Salmonella antistoffer koblet til FITC at markere bakterier med adgang til cytosolen. Efter yderligere vask smarte Cellerne lyseres og procentdelen af mCherry + (vakuolær) og FITC + / mCherry + (cytosol) bakterier bestemmes ved FACS. Vi rapporterer også en tilpasning af denne fremgangsmåde, som kan anvendes, hvis der ikke fluorescerende protein-udtrykkende stammer er tilgængelige (figur 2). Yderligere trin introduceres efter FITC mærkning, hvor cellerne er faste og helt permeabiliseres. Derefter alle bakterier farves med anti Salmonella antistoffer og tilsvarende sekundære antistoffer. Detfdeling derpå gjort ved mikroskopi i stedet for FACS-analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskellen permeabilisering er en let og robust metode til at analysere og kvantificere den subcellulære fordeling af bakterielle patogener mellem vakuolære rum og cytosolen. Det samme assay er blevet anvendt med succes med bakterier såsom Francisella novicida 2,4 og Shigella flexneri 12. Men da mange intracellulært patogen ændre eller modificere værten endomembrane strukturer, vil robustheden af digitonin permeabilisering skal bestemmes på et individuelt grundlag. Fi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende Mathias S. Dick, Roland F. Dreier og Sebastian Rühl til diskussion. Dette arbejde blev støttet af en SNSF professorat PP00P3_139120 / 1 og en University of Basel projekttilskud ID2153162 til PB
Materials
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
