Quantification des cytosolique vs Vacuolar<em> Salmonella</em> Dans les macrophages primaires par différentiel Perméabilisation

Summary

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Abstract

Bactéries pathogènes intracellulaires peuvent se répliquer dans le cytosol ou dans les vacuoles contenant des agents pathogènes spécialisés (PCV). Pour atteindre le cytosol, des bactéries telles que Shigella flexneri et Francisella novicida besoin pour induire la rupture du phagosome. En revanche, Salmonella typhimurium se réplique dans un compartiment vacuolaire, connu sous le nom de Salmonella vacuole contenant (SCV). Cependant certains mutants de Salmonella ne parviennent pas à maintenir l'intégrité SCV et sont ainsi libérés dans le cytosol. Le pourcentage de bactéries par rapport cytosolique vacuolaires sur le niveau de bactéries individuelles peut être mesurée par perméabilisation différentiel, également connu comme dosage phagosome-protection. L'approche fait usage de la propriété de détergent digitonine à se lier sélectivement cholestérol. Étant donné que la membrane plasmique contient plus de cholestérol que les autres membranes cellulaires, la digitonine peut être utilisé pour perméabiliser sélectivement la membrane plasmique tout en laissant les membranes intracellulairesintact. En bref, suivant l'infection par l'agent pathogène exprimant une protéine marqueur fluorescent (par exemple mCherry entre autres), la membrane plasmique des cellules hôtes est perméabilisées par une courte incubation dans un tampon contenant de la digitonine. Les cellules sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps primaire (couplé à un fluorophore voulue) dirigé contre la bactérie de choix (par exemple FITC anti- Salmonella) et lavées de nouveau. Si les bactéries non marquées sont utilisées, une étape supplémentaire peut être effectuée, dans lequel toutes les membranes sont perméabilisées et toutes les bactéries colorées avec un anticorps correspondant. Suite à la coloration, le pourcentage de bactéries vacuolaires cytosoliques et peut être quantifiée par FACS ou par microscopie compter les événements simples ou doubles-positives. Ici, nous fournissons des détails expérimentaux pour l'utilisation de cette technique par la bactérie Salmonella typhimurium. L'avantage de ce test est que, contrairement à l'autre dosage, il fournit une quantification du niveau de seul bacteria, et si analysée par microscopie fournit le nombre exact de bactéries cytosolique et vacuolaires dans une cellule donnée.

Introduction

Les bactéries pathogènes intracellulaires se répliquent soit directement dans le cytosol de la cellule hôte, ou dans des compartiments spécialisés vacuolaires ^1. Durant la phase initiale de l'infection la plupart des pathogènes se internalisés soit par phagocytose par des cellules spécialisées (telles que les macrophages) ou par la promotion active de leur propre absorption dans des cellules non-phagocytaires. Dans les cellules phagocytaires, le phagosome fusionne généralement avec les lysosomes pour former un compartiment de dégradation, où les particules phagocytées sont digérés. Cytosoliques bactéries spécialisées, telles que Francisella novicida ou Shigella flexneri, échapper à la dégradation du phagosome en induisant la rupture du phagosome et d'échapper par la suite dans le cytosol ^2,3. Cela nécessite mécanisme de virulence associés tels que l'île Francisella pathogénicité (FPI) ou Shigella flexneri SST3, qui injecte des protéines effectrices qui favorisent vacuolaire rupture ^2-4. Les caractéristiques de cytosol de la cellule hôteun certain nombre de récepteurs conservés de reconnaissance des formes qui reconnaissent normalement la présence de pathogènes et induisent immunitaire inné signalisation ^5. En outre, xenophagy, une forme anti-microbienne de l'autophagie peut dégrader les bactéries qui pénètrent dans le cytosol. Cytosoliques bactéries sont normalement bien adaptés à émousser ou de contourner ces réponses en utilisant différentes stratégies. Par exemple, Francisella modifie ses LPS pour éviter la reconnaissance de l'hôte et Shigella empêche le recrutement de l'autophagie en utilisant des protéines effectrices sécrétées ^6,7.

Une autre stratégie pour échapper à la dégradation lysosomale est employé par le modèle vacuolaire pathogène Salmonella enterica sérotype Typhimurium, par la suite dénommée Salmonella typhimurium. Salmonella utilise un SST3 d'injecter effecteurs qui remodèlent le phagosome initiale dans sa niche intracellulaire, la Salmonella contenant vacuole (SCV) ^8,9. La manipulation continue des voies d'accueil estnécessaire pour maintenir cette vacuole en recrutant des lipides et autres nutriments vers la vacuole. En effet, un mutant de Salmonella SIFA ne parvient pas à maintenir la stabilité vacuolaire, et pénètre dans le cytosol des cellules hôtes en quelques heures après l'infection, ce qui conduit à l'activation des voies immunitaires innées et le recrutement de autophagie ^8. Évasion Vacuolar de Salmonella varie en fonction du type de cellule qui est des études, et plusieurs rapports ont montré que dans les cellules épithéliales même WT Salmonella peut échapper à la SCV et hyperreplicate dans le cytosol ^10. Des rapports récents montrent que la détection immunitaire innée des pathogènes vacuolaires dépend aussi de la capacité de l'hôte à reconnaître et à déstabiliser vacuoles contenant pathogènes (PCV) ^11-14.

Étant donné que l'hôte ou des bactéries génotype peuvent affecter la distribution des bactéries intracellulaires entre le vacuolaire et le compartiment cytosolique, il est nécessaire de quantifier le nombre de vacuolaire vs.bactéries cytosoliques. Etant donné que, dans la plupart des configurations expérimentales cellules hôtes sont infectées avec plus d'une bactérie, et par la suite peuvent abriter plusieurs bactéries dans différents compartiments sous-cellulaires, une technique est nécessaire qui permet la quantification de la teneur en bactéries simples. Perméabilisation sélective (également connu sous le nom d'essai de protection phagosome) fournit cette résolution ^2,4,10,12. Le dosage est basé sur la perméabilisation sélective de la membrane plasmique de la cellule hôte avec le détergent digitonine, ce qui laisse les membranes vacuolaires intact et permet ainsi la coloration sélective de bactéries avec des anticorps cytosoliques. Ici, nous fournissons deux protocoles de quantification des cytosolique et vacuolaire Salmonella typhimurium en utilisant perméabilisation différentiel. Le principe de cette méthode est décrite dans la figure 1: les macrophages de moelle osseuse dérivés (BMDMs) sont infectées avec phase stationnaire mCherry exprimant Salmonella. Phase stationnaire Salmonella besoin to être utilisés car ils régulent à la baisse l'expression de la SPI-1 SST3, dont l'activité serait autrement reconnu par l'inflammasome NLRC4 et induire la mort cellulaire rapide (pyroptosis) de la BMDMs ^15. Suite à l'infection des cellules sont lavées et traitées avec 50 pg / ml de digitonine pendant 1 minute. Les cellules sont lavées de nouveau et immédiatement incubées avec des anticorps anti-Salmonella couplés au FITC pour marquer des bactéries avec accès au cytosol. Après un lavage supplémentaire cellules sont lysées de pas et le pourcentage de mCherry + (vacuolaire) et FITC + / + mCherry (cytosolique) de bactéries est déterminée par FACS. Nous présentons également une adaptation de ce procédé qui peut être utilisé en l'absence de souches exprimant des protéines fluorescentes sont disponibles (Figure 2). Des étapes supplémentaires sont introduites après l'étiquetage FITC dans lequel les cellules sont fixées et complètement perméabilisées. Par la suite, toutes les bactéries sont colorées avec des anticorps anti-Salmonella et des anticorps secondaires correspondantes. Detection se fait alors par microscopie à la place de l'analyse FACS.

Protocol

1. Digitonine Assay avec mCherry exprimant Salmonella (FACS-base Analyse) Préparation des bactéries Remarque: Salmonella de type sauvage SL1344 (Résistance à la streptomycine) exprimant mCherry partir d'un plasmide (pFPV codant mCherry sous le promoteur de RPSM) est utilisé dans cet essai. Phagocytose bactérienne et la prolifération où pas modifiée par l'expression constitutive de mCherry (données non présentées) 16. Inoculer la souche 1 jour av…

Representative Results

Figure 1 et la Figure 2 montrent les schémas de l'essai de digitonine décrites dans le protocole 1 et 2 du protocole illustrant les étapes critiques dans le protocole et les résultats obtenus. La figure 3 montre des résultats typiques FACS. Les contrôles positifs et négatifs sont utilisés pour définir les portes pour mCherry + / bactéries (FITC vacuolaire Salmonella) et mCherry + / FITC + bactéries Salmonella (cytosolique). Sur la base de ces portes, le pour…

Discussion

Perméabilisation différentiel est une méthode simple et robuste pour analyser et de quantifier la distribution subcellulaire des bactéries pathogènes entre les compartiments vacuolaires et le cytosol. Le même essai a été utilisé avec succès par des bactéries telles que Francisella novicida ^2,4 et ¹² Shigella flexneri. Cependant, étant donné que beaucoup pathogène intracellulaire altérer ou modifier les structures endomembranaires d'accueil, la robustesse de la p…

Materials

Digitonin	Sigma	D5628	50ug/mL
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Potassium Acetate	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponin	Sigma	47036
Vectashield mounting medium	Vectorlabs	H-1200
Anti Rabbit antibody-488	Molecular Probes	A-11070	1/500
Glycine	Sigma	G8898
Gentamicin	Life Technologies	15710-49	100ug/mL and 10ug/mL
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Confocal microscope	Zeiss		imaging done at 63x
FACS Fortessa	BD technologies		detection mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		detection FITC 530 nm