Quantification des cytosolique vs Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Dans les macrophages primaires par différentiel Perméabilisation

Résumé

Nous décrivons la quantification de Salmonella typhimurium cytosolique et vacuolaire dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse en utilisant la perméabilisation différentielle des digitonines.

Résumé

Bactéries pathogènes intracellulaires peuvent se répliquer dans le cytosol ou dans les vacuoles contenant des agents pathogènes spécialisés (PCV). Pour atteindre le cytosol, des bactéries telles que Shigella flexneri et Francisella novicida besoin pour induire la rupture du phagosome. En revanche, Salmonella typhimurium se réplique dans un compartiment vacuolaire, connu sous le nom de Salmonella vacuole contenant (SCV). Cependant certains mutants de Salmonella ne parviennent pas à maintenir l'intégrité SCV et sont ainsi libérés dans le cytosol. Le pourcentage de bactéries par rapport cytosolique vacuolaires sur le niveau de bactéries individuelles peut être mesurée par perméabilisation différentiel, également connu comme dosage phagosome-protection. L'approche fait usage de la propriété de détergent digitonine à se lier sélectivement cholestérol. Étant donné que la membrane plasmique contient plus de cholestérol que les autres membranes cellulaires, la digitonine peut être utilisé pour perméabiliser sélectivement la membrane plasmique tout en laissant les membranes intracellulairesintact. En bref, suivant l'infection par l'agent pathogène exprimant une protéine marqueur fluorescent (par exemple mCherry entre autres), la membrane plasmique des cellules hôtes est perméabilisées par une courte incubation dans un tampon contenant de la digitonine. Les cellules sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps primaire (couplé à un fluorophore voulue) dirigé contre la bactérie de choix (par exemple FITC anti- Salmonella) et lavées de nouveau. Si les bactéries non marquées sont utilisées, une étape supplémentaire peut être effectuée, dans lequel toutes les membranes sont perméabilisées et toutes les bactéries colorées avec un anticorps correspondant. Suite à la coloration, le pourcentage de bactéries vacuolaires cytosoliques et peut être quantifiée par FACS ou par microscopie compter les événements simples ou doubles-positives. Ici, nous fournissons des détails expérimentaux pour l'utilisation de cette technique par la bactérie Salmonella typhimurium. L'avantage de ce test est que, contrairement à l'autre dosage, il fournit une quantification du niveau de seul bacteria, et si analysée par microscopie fournit le nombre exact de bactéries cytosolique et vacuolaires dans une cellule donnée.

Introduction

Les bactéries pathogènes intracellulaires se répliquent soit directement dans le cytosol de la cellule hôte, ou dans des compartiments spécialisés vacuolaires ^1. Durant la phase initiale de l'infection la plupart des pathogènes se internalisés soit par phagocytose par des cellules spécialisées (telles que les macrophages) ou par la promotion active de leur propre absorption dans des cellules non-phagocytaires. Dans les cellules phagocytaires, le phagosome fusionne généralement avec les lysosomes pour former un compartiment de dégradation, où les particules phagocytées sont digérés. Cytosoliques bactéries spécialisées, telles que Francisella novicid....

Protocole

1. Digitonine Assay avec mCherry exprimant Salmonella (FACS-base Analyse)

1. Préparation des bactéries
   Remarque: Salmonella de type sauvage SL1344 (Résistance à la streptomycine) exprimant mCherry partir d'un plasmide (pFPV codant mCherry sous le promoteur de RPSM) est utilisé dans cet essai. Phagocytose bactérienne et la prolifération où pas modifiée par l'expression constitutive de mCherry (données non présentées) ^16.
   1. Inoculer la souche 1 jour avant l'infection dans 3 ml de milieu LB additionné de streptomycine (90 ug / ml) et de l'ampicilline (100 ug / ml, vecteur exprimant mCherry) dans un agita....

Résultats

Figure 1 et la Figure 2 montrent les schémas de l'essai de digitonine décrites dans le protocole 1 et 2 du protocole illustrant les étapes critiques dans le protocole et les résultats obtenus. La figure 3 montre des résultats typiques FACS. Les contrôles positifs et négatifs sont utilisés pour définir les portes pour mCherry + / bactéries (FITC vacuolaire Salmonella) et mCherry + / FITC + bactéries Salmonella (cytosolique). Sur la base de ces portes, le pourcentage de .......

Discussion

Perméabilisation différentiel est une méthode simple et robuste pour analyser et de quantifier la distribution subcellulaire des bactéries pathogènes entre les compartiments vacuolaires et le cytosol. Le même essai a été utilisé avec succès par des bactéries telles que Francisella novicida ^2,4 et ¹² Shigella flexneri. Cependant, étant donné que beaucoup pathogène intracellulaire altérer ou modifier les structures endomembranaires d'accueil, la robustesse de la perméabilisation.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Digitonin	Sigma	D5628	50 &mu ; g/ml
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Acétate de potassium	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponin	Sigma	47036
Vectashield support de montage	Vectorlabs	H-1200
Anti Rabbit antibody-488	Moléculaire Sondes	A-11070	1/500
Glycine	Sigma	G8898
Gentamicin	Life Technologies	15710-49	100 &mu ; g/ml et 10 &mu ; g/ml
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Microscope confocal Imagerie	Zeiss		réalisée à 63X
FACS Fortessa	BD technologies		détection mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		détection FITC 530 nm