כימות של Cytosolic לעומת vacuolar<em> סלמונלה</em> ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization
Summary
We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Abstract
חיידקים פתוגנים תאיים יכול לשכפל בcytosol או בvacuoles מיוחד המכיל הפתוגן (PCVs). כדי להגיע cytosol, חיידקים כמו Shigella flexneri וFrancisella novicida צריכים לגרום לקרע של phagosome. לעומת זאת, typhimurium סלמונלה משכפל בתא vacuolar, הידוע בשם vacuole סלמונלה המכיל (SCV). מוטציות עם זאת מסוימות של סלמונלה להיכשל כדי לשמור על שלמות SCV ומשתחררים כך לתוך cytosol. אחוז cytosolic לעומת חיידקי vacuolar על הרמה של חיידקים בודדים ניתן למדוד על ידי permeabilization ההפרש, הידוע גם בassay phagosome-ההגנה. הגישה עושה שימוש ברכוש של digitonin חומר הניקוי כדי לאגד כולסטרול באופן סלקטיבי. מאז קרום הפלזמה מכיל יותר כולסטרול מאשר קרומים תאיים אחרים, digitonin יכול לשמש כדי permeabilize סלקטיבי קרום הפלזמה תוך השארת קרומים תאייםבשלמותה. בזיהום קצר, הבא עם הפתוגן לבטא חלבון סמן פלואורסצנטי (למשל mCherry בין השאר), קרום הפלזמה של תאי מארח permeabilized עם דגירה קצרה בdigitonin מכילה מאגר. לאחר מכן תאים נשטפים וטופחו עם נוגדן ראשוני (מצמידים את fluorophore בחירה) המכוון נגד החיידק של בחירה (למשל אנטי סלמונלה -FITC) ושטפו שוב. אם חיידקים לא מסומנים משמשים, ניתן לעשות צעד נוסף, שבו כולם קרומי permeabilized וכל החיידקים מוכתמים עם נוגדן מקביל. בעקבות הצביעה, אחוז חיידקי vacuolar וcytosolic ניתן לכמת על ידי FACS או במיקרוסקופ על ידי ספירת אירועים חד או דו-חיוביים. כאן אנו מספקים פרטים ניסיוניים לשימוש בטכניקה זו עם typhimurium סלמונלה החיידק. היתרון של assay זה הוא כי, בניגוד לassay האחר, היא מספקת כימות ברמה של bacte אחתריה, ואם נותח על ידי מיקרוסקופ מספק את המספר המדויק של cytosolic וחיידקים vacuolar בתא נתון.
Introduction
חיידקים פתוגנים תאיים לשכפל באופן ישיר בcytosol התא המארח, או בתאי vacuolar מיוחדים 1. בשלב הראשוני של הזיהום ביותר פתוגנים לקבל הפנימו או על ידי phagocytosis על ידי תאים מיוחדים (כגון מקרופאגים) או על ידי פעיל בקידום הספיגה שלהם לתאים שאינם phagocytic. בתאי phagocytic, phagosome בדרך כלל משלב עם lysosomes כדי ליצור תא נגרע, שבו חלקיקי phagocytosed מתעכלים. חיידקי cytosolic מיוחדים, כגון Francisella novicida או Shigella flexneri, לברוח השפלה phagosomal ידי גרימת הקרע של phagosome ולאחר מכן לברוח ל2,3 cytosol. זה דורש מנגנון הקשורים ארסי כגון פתוגניות אי Francisella (FPI) או Shigella flexneri T3SS, שמזריק חלבוני מפעיל המקדמים קרע vacuolar 2-4. תכונות cytosol התא המארחמספר הקולטנים זיהוי תבניות נשמרים, כי בדרך כלל לזהות את הנוכחות של פתוגנים ולגרום לחיסון מולדים איתות 5. בנוסף, xenophagy, צורה אנטי-מיקרוביאלי של autophagy יכולה לבזות חיידקים שנכנסים cytosol. חיידקי cytosolic בדרך כלל גם מותאמים ללהקהות או לעקוף תגובות אלה באמצעות אסטרטגיות שונות. לדוגמא, Francisella משנה LPS כדי להימנע מהכרת המארח וShigella מונע גיוס autophagy באמצעות חלבונים מופרשים מפעיל 6,7.
אסטרטגיה נוספת לברוח השפלה lysosomal מועסקת על ידי Typhimurium serovar enterica הפתוגן vacuolar המודל סלמונלה, התייחס לאחר מכן כלtyphimurium סלמונלה. סלמונלה משתמשת T3SS להזריק effectors שלשפץ phagosome הראשוני לנישה תאית שלה, סלמונלה המכיל vacuole (SCV) 8,9. מניפולציה מתמשכת של מסלולי מארח היאנחוץ כדי לשמור על vacuole זאת על ידי גיוס שומנים וחומרים מזינים אחרים לvacuole. ואכן, מוטציה SIFA של סלמונלה לא מצליחה לשמור על יציבות vacuolar, ונכנסה cytosol של תאי מארח בתוך שעות לאחר הדבקה, וכתוצאה מכך ההפעלה של מסלולי חיסון מולדים וגיוס autophagy 8. בריחת vacuolar של סלמונלה משתנה בהתאם לסוג התא שהוא לימודים, וכמה מחקרים הראו כי בתאי אפיתל אפילו WT סלמונלה יכולה לברוח SCV וhyperreplicate בcytosol 10. הדיווחים אחרונים מראים כי זיהוי חיסון מולדים של פתוגנים vacuolar גם תלוי ביכולת של המארח להכיר ולערער vacuoles המכיל הפתוגן (PCVs) 11-14.
בהתחשב בכך ששניהם המארח או חיידקי גנוטיפ יכול להשפיע על ההפצה של חיידקים תאיים בין vacuolar ותא cytosolic, יש צורך לכמת את מספר לעומת vacuolarחיידקי cytosolic. מאז, בהגדרות ניסיוניות רוב תאי מארח נגועים בחיידק אחד או יותר, ולאחר מכן יכולים נמל כמה חיידקים בתאי subcellular שונים, יש צורך בטכניקה המאפשרת כימות ברמה של חיידקים בודדים. permeabilization ההפרש (הידוע גם בassay הגנת phagosomal) מספק רזולוציה זו 2,4,10,12. Assay מבוסס על permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה התא המארח עם digitonin חומר הניקוי, מה שמשאיר את קרומי vacuolar שלמים ובכך מאפשר צביעה סלקטיבית של חיידקי cytosolic עם נוגדנים. כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים לכימות של cytosolic וvacuolar typhimurium סלמונלה באמצעות permeabilization ההפרש. העיקרון של שיטה זו מתואר באיור 1: מקרופאגים מח העצם נגזרים (BMDMs) נגועים בשלב נייח mCherry להביע סלמונלה. השלב נייח סלמונלה צריכה to לשמש כי הם downregulate הביטוי של T3SS SPI-1, שפעילותם אמורה היה להיות מוכרת על ידי inflammasome NLRC4 ולגרום למוות מהיר של תאים (pyroptosis) של 15 BMDMs. בעקבות זיהום תאים נשטפים וטופלו עם 50 / מיליליטר מיקרוגרם של digitonin דקה 1. תאים נשטפים שוב מייד וטופחו עם נוגדנים נגד סלמונלה מצמידים את FITC לסמן חיידקים עם גישה לcytosol. לאחר שטיפה נוספת תאי צעד הם lysed ואחוז mCherry + (vacuolar) וFITC + / mCherry + (cytosolic) החיידקים נקבע על ידי FACS. כמו כן, אנו מדווחים על הסתגלות של שיטה זו, שניתן להשתמש אם אין זנים להביע חלבון פלואורסצנטי זמינים (איור 2). צעדים נוספים שהוכנסו לאחר תיוג FITC שבו תאים הם קבועים וpermeabilized לחלוטין. לאחר מכן כל חיידקי מגואלות נוגדנים נגד סלמונלה ונוגדנים משני המתאימים. Detשיקוף מכן על ידי מיקרוסקופ במקום ניתוח FACS.
Protocol
Representative Results
Discussion
permeabilization ההפרש הוא שיטה קלה וחזקה כדי לנתח ולכמת את הפצת subcellular של חיידקים פתוגנים בין תאי vacuolar וcytosol. אותו assay שמש בהצלחה עם חיידקים כגון Francisella novicida 2,4 וShigella flexneri 12. עם זאת, מאחר שרבי הפתוגן תאיים לשנות או לשנות את מבני endomembrane מארח, על חוסנו של permeabi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות מתיאס ס דיק, רולנד פ Dreier וסבסטיאן רול לדיון. עבודה זו נתמכה על ידי קתדרת PP00P3_139120 SNSF / 1 וID2153162 פרויקט מענק אוניברסיטת באזל לPB
Materials
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
