Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em> Salmonella</em> In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

Summary

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Abstract

Batteri patogeni intracellulari possono replicarsi nel citosol o in vacuoli-patogeni contenenti specializzati (PCV). Per raggiungere il citosol, batteri come Shigella flexneri e Francisella novicida devono indurre la rottura del phagosome. Al contrario, Salmonella typhimurium replica in un vano vacuolare, conosciuto come Salmonella vacuole -contenenti (SCV). Tuttavia alcuni mutanti di Salmonella non riescono a mantenere l'integrità SCV e sono quindi rilasciate nel citoplasma. La percentuale di citosolico contro batteri vacuolare a livello di singoli batteri può essere misurata permeabilizzazione differenziale, noto anche come test fagosoma protezione. L'approccio fa uso della proprietà di detersivo digitonina di legarsi selettivamente colesterolo. Poiché la membrana plasmatica contiene più colesterolo che altre membrane cellulari, digitonina può essere utilizzato per permeabilize selettivamente la membrana plasmatica lasciando membrane intracellulariintatto. In breve, dopo l'infezione con l'agente patogeno che esprimono una proteina marcatore fluorescente (es mCherry tra gli altri), la membrana plasmatica delle cellule ospiti è permeabilizzate con una breve incubazione in digitonina contenente tampone. Le cellule vengono quindi lavate ed incubate con un anticorpo primario (accoppiato ad un fluoroforo di scelta) diretto contro il batterio di scelta (ad esempio anti-Salmonella -FITC) e nuovamente lavati. Se si utilizzano i batteri non marcati, un passaggio aggiuntivo può essere fatto, in cui tutte le membrane vengono permeabilizzate e tutti i batteri colorate con un anticorpo corrispondente. Dopo la colorazione, la percentuale di vacuolari e citosolici batteri può essere quantificata mediante FACS o microscopia contando eventi singoli o doppi-positive. Qui forniamo dettagli sperimentali per l'uso di questa tecnica con il batterio Salmonella typhimurium. Il vantaggio di questo saggio è che, a differenza di altre analisi, fornisce una quantificazione del livello di singola bacteria, e se analizzata al microscopio fornisce il numero esatto di citosolico e batteri vacuolari in una data cellula.

Introduction

Batteri patogeni intracellulari replicano direttamente nel citoplasma della cellula ospite, o in scomparti vacuolari specializzati ^1. Durante la fase iniziale dell'infezione maggior patogeni vengono internalizzati mediante fagocitosi da cellule specializzate (come macrofagi) o promuovendo attivamente il proprio assorbimento nelle cellule non fagocitiche. Nelle cellule fagocitiche, phagosome normalmente fonde con lisosomi per formare un vano degradativa, dove vengono digeriti particelle fagocitati. Batteri citosolici specializzati, come ad esempio Francisella novicida o Shigella flexneri, fuga degrado phagosomal inducendo la rottura del phagosome e successivamente fuga nel ^2,3 citoplasma. Ciò richiede meccanismo di virulenza associata come la Francisella patogenicità Island (FPI) o la Shigella flexneri T3SS, che inietta le proteine ​​effettrici che promuovono vacuolar rottura ^2-4. Le caratteristiche citosol della cellula ospiteun numero di recettori pattern recognition conservati che normalmente riconoscono la presenza di agenti patogeni e inducono immunitaria innata segnalazione ^5. Inoltre, xenophagy, una forma antimicrobica dell'autofagia può degradare batteri che entrano nel citosol. Batteri citosoliche sono normalmente ben adattati per smussare o aggirare queste risposte utilizzando diverse strategie. Ad esempio, Francisella modifica le sue LPS per non farsi riconoscere host e Shigella impedisce l'autofagia reclutamento utilizzando secrete proteine ​​effettrici ^6,7.

Un'altra strategia per sfuggire degradazione lisosomiale è impiegato dal modello vacuolare patogeno Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, di seguito la Salmonella typhimurium. Salmonella utilizza un T3SS per iniettare effettori che rimodellano phagosome iniziale in sua nicchia intracellulare, la Salmonella -contenenti vacuolo (SCV) ^8,9. Manipolazione continua di percorsi di accoglienza ènecessaria per mantenere questo vacuolo attraverso l'assunzione di lipidi e altre sostanze nutritive per il vacuolo. In effetti, un mutante Sifa di Salmonella non riesce a mantenere la stabilità vacuolar, ed entra nel citoplasma delle cellule ospiti poche ore dopo l'infezione, che si traduce nell'attivazione di percorsi immunitario innato e l'autofagia reclutamento ^8. Fuga vacuolare di Salmonella varia a seconda del tipo di cellula che gli studi e numerose relazioni hanno dimostrato che nelle cellule epiteliali anche WT Salmonella può sfuggire la SCV e hyperreplicate nel citosol ^10. Recenti rapporti indicano che la diagnosi immunitario innato di patogeni vacuolari dipende anche dalla capacità di accoglienza di riconoscere e destabilizzare vacuoli da organismi patogeni che contiene (PCV) ^11-14.

Dato che sia l'host o batteri genotipo possono influenzare la distribuzione dei batteri intracellulari tra vacuolare e compartimento citosolico, è necessario quantificare il numero di vacuolare vs.batteri citosolici. Poiché, in configurazioni più sperimentali cellule ospiti sono infettate con più di un batterio, e successivamente può ospitare diversi batteri in differenti compartimenti subcellulari, è necessaria una tecnica che consente la quantificazione del livello di singoli batteri. Permeabilizzazione differenziale (noto anche come test di protezione phagosomal) fornisce la presente risoluzione ^2,4,10,12. Il saggio si basa sulla permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica della cellula ospite con la digitonina detersivo, che lascia membrane vacuolare intatta e consente così la colorazione selettiva di batteri citosolici con anticorpi. Qui forniamo due protocolli per la quantificazione dei citosolica e vacuolare Salmonella typhimurium con permeabilizzazione differenziale. Il principio di questo metodo è descritto nella Figura 1: di midollo osseo macrofagi derivati ​​(BMDMs) sono infettati con fase stazionaria mCherry esprimono Salmonella. Fase stazionaria Salmonella bisogno to essere utilizzato in quanto downregulate l'espressione della SPI-1 T3SS, la cui attività sarebbe altrimenti essere riconosciuto dal inflammasome NLRC4 e indurre la morte delle cellule rapido (pyroptosis) del BMDMs ^15. Dopo l'infezione le cellule sono lavate e trattati con 50 ug / ml di digitonina per 1 minuto. Le cellule vengono nuovamente lavati immediatamente e incubate con anticorpi anti-Salmonella accoppiati a FITC marcare batteri con accesso al citosol. Dopo un ulteriore lavaggio cellule passo vengono lisate e la percentuale di batteri mCherry + (vacuolare) e FITC + / + mCherry (citosolica) è determinata da FACS. Riportiamo anche un adattamento di questo metodo che può essere utilizzato se non ceppi proteine ​​esprimono fluorescenti sono disponibili (Figura 2). I passaggi aggiuntivi vengono introdotte dopo l'etichettatura FITC in cui le cellule sono fissi e completamente permeabilizzate. Successivamente tutti i batteri sono macchiati con anticorpi anti-Salmonella e anticorpi secondari corrispondenti. Detezione viene poi eseguita al microscopio invece di analisi FACS.

Protocol

1. Digitonin Assay con mCherry esprimono Salmonella (FACS-based Analysis) Batteri Preparazione Nota: Salmonella wild-type SL1344 (streptomicina resistente) che esprime mCherry da un plasmide (pFPV codifica mCherry sotto il promotore RPSM) viene utilizzato in questo test. Fagocitosi batterica e la proliferazione in cui non alterata dalla espressione costitutiva di mCherry (dati non riportati) 16. Inoculare il ceppo 1 giorno prima della infezione in 3 ml di terreno L…

Representative Results

Figura 1 e Figura 2 mostra gli schemi del test digitonina descritti nel protocollo 1 e 2 del protocollo che illustrano le fasi critiche del protocollo e dei risultati ottenuti. La figura 3 mostra tipici FACS risultati. I controlli positivi e negativi vengono utilizzati per impostare le porte per mCherry + / batteri FITC (vacuolar Salmonella) e mCherry + / FITC + batteri (citosolico Salmonella). Sulla base di queste porte la percentuale di batteri citosolici e vacuolari pu?…

Discussion

Permeabilizzazione differenziale è un metodo facile e robusto per analizzare e quantificare la distribuzione subcellulare di batteri patogeni tra compartimenti vacuolari e citoplasma. Lo stesso test è stato utilizzato con successo con batteri come Francisella novicida ^2,4 e Shigella flexneri ^12. Tuttavia, dal momento che molti patogeni intracellulari alterare o modificare le strutture endomembrane ospitanti, la robustezza della permeabilizzazione digitonina dovrà essere determi…

Materials

Digitonin	Sigma	D5628	50ug/mL
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Potassium Acetate	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponin	Sigma	47036
Vectashield mounting medium	Vectorlabs	H-1200
Anti Rabbit antibody-488	Molecular Probes	A-11070	1/500
Glycine	Sigma	G8898
Gentamicin	Life Technologies	15710-49	100ug/mL and 10ug/mL
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Confocal microscope	Zeiss		imaging done at 63x
FACS Fortessa	BD technologies		detection mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		detection FITC 530 nm