Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em> Salmonella</em> En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

Summary

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Abstract

Patógenos bacterianos intracelulares pueden replicar en el citosol o en las vacuolas que contienen patógenos especializados (PCV). Para alcanzar el citosol, bacterias como Shigella flexneri y Francisella novicida necesidad de inducir la ruptura del fagosoma. En contraste, Salmonella typhimurium se replica en un compartimiento vacuolar, conocida como Salmonella vacuola -Con (SCV). Sin embargo, ciertos mutantes de Salmonella fallan para mantener la integridad SCV y por lo tanto son liberados en el citosol. El porcentaje de citosólica vs. bacterias vacuolares en el nivel de bacterias individuales se puede medir por permeabilización diferencial, también conocido como ensayo de protección fagosoma. El enfoque hace uso de la propiedad de digitonina detergente para unirse selectivamente el colesterol. Puesto que la membrana de plasma contiene más colesterol que otras membranas celulares, digitonina se puede utilizar para permeabilizar selectivamente la membrana del plasma mientras que deja las membranas intracelularesintacta. En breve, después de la infección con el patógeno que expresa una proteína marcador fluorescente (por ejemplo mCherry entre otros), la membrana plasmática de las células huésped se permeabilizaron con una breve incubación en digitonina que contiene tampón. Después las células se lavaron y se incubaron con un anticuerpo primario (acoplado a un fluoróforo de elección) dirigido contra la bacteria de elección (por ejemplo, Salmonella anti- FITC) y se lavaron de nuevo. Si se utilizan bacterias no marcados, un paso adicional se puede hacer, en la que todas las membranas se permeabilizaron y todas las bacterias teñidas con un anticuerpo correspondiente. Después de la tinción, el porcentaje de bacterias vacuolares y citosólicas se puede cuantificar mediante FACS o microscopía por conteo de eventos individuales o de doble positivo. Aquí proporcionamos detalles experimentales para el uso de esta técnica con la bacteria Salmonella typhimurium. La ventaja de este ensayo es que, en contraste con otro ensayo, proporciona una cuantificación del nivel de solo bacteria, y si analizada por microscopía proporciona el número exacto de citosólicas y bacterias vacuolares en una célula dada.

Introduction

Patógenos bacterianos intracelulares se replican ya sea directamente en el citosol de la célula huésped, o en compartimentos vacuolar especializados ^1. Durante la etapa inicial de la infección mayoría de los patógenos internalizados obtener ya sea por fagocitosis por células especializadas (como los macrófagos) o promoviendo activamente su propia absorción en células no fagocíticas. En las células fagocíticas, el fagosoma normalmente se fusiona con los lisosomas para formar un compartimiento degradativa, donde se digieren las partículas fagocitadas. Bacterias citosólicas especializados, tales como Francisella novicida o Shigella flexneri, escapan degradación phagosomal mediante la inducción de la ruptura de la fagosoma y posteriormente escapan al ^2,3 citosol. Esto requiere mecanismo de virulencia asociada como la Isla Francisella Patogenicidad (FPI) o la Shigella flexneri SST3, que inyecta proteínas efectoras que promueven vacuolar ruptura ^2-4. Las características de citosol de la célula huéspedun número de receptores de reconocimiento de patrones conservados que normalmente reconocen la presencia de patógenos e inducen la señalización inmune innato ^5. Además, xenophagy, una forma anti-microbiana de la autofagia puede degradar las bacterias que entran en el citosol. Bacterias citosólicas normalmente se adaptan bien a mitigar o evitar estas respuestas utilizando diferentes estrategias. Por ejemplo, Francisella modifica sus LPS para evitar el reconocimiento de acogida y Shigella impide el reclutamiento autofagia utilizando proteínas efectoras secretadas ^6,7.

Otra estrategia para escapar de la degradación lisosomal es empleado por el patógeno modelo vacuolar Salmonella enterica serovar Typhimurium, denominado a partir de entonces como Salmonella typhimurium. Salmonella utiliza un SST3 para inyectar efectores que remodelan el fagosoma inicial en su nicho intracelular, la Salmonella -Con vacuola (SCV) ^8,9. La manipulación continua de las vías de acogida esnecesaria para mantener esta vacuola mediante la contratación de lípidos y otros nutrientes para la vacuola. De hecho, un mutante de Salmonella SIFA falla para mantener la estabilidad vacuolar, y entra en el citosol de las células huésped dentro de horas después de la infección, lo que resulta en la activación de vías inmunes innatas y reclutamiento autofagia ^8. Escapar vacuolar de Salmonella varía dependiendo del tipo de células que son los estudios, y varios informes han demostrado que en las células epiteliales incluso WT Salmonella puede escapar del SCV y hyperreplicate en el citosol ^10. Informes recientes muestran que la detección inmune innato de patógenos vacuolar también depende de la capacidad del huésped para reconocer y desestabilizar vacuolas que contienen patógenos (PCV) ^11-14.

Dado que tanto el anfitrión o bacterias genotipo pueden afectar a la distribución de bacterias intracelulares entre el vacuolar y el compartimento citosólico, es necesario cuantificar el número de vacuolar vs.bacterias citosólica. Dado que, en configuraciones más experimentales células huésped se infectan con más de una bacteria, y posteriormente puede albergar varias bacterias en diferentes compartimentos subcelulares, se necesita una técnica que permite la cuantificación del nivel de bacterias individuales. Permeabilización diferencial (también conocido como ensayo de protección de phagosomal) proporciona esta resolución ^2,4,10,12. El ensayo se basa en la permeabilización selectiva de la membrana plasmática de la célula huésped con el detergente digitonina, lo que deja las membranas vacuolares intacta y por lo tanto permite la tinción selectiva de bacterias citosólicas con anticuerpos. Aquí proporcionamos dos protocolos para la cuantificación de citosólicas y vacuolar Salmonella typhimurium usando diferencial permeabilización. El principio de este método se describe en la Figura 1: macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) están infectadas con fase estacionaria mCherry-expresión de Salmonella. Fase estacionaria Salmonella necesita to ser utilizado debido a que regulan negativamente la expresión de la SPI-1 T3SS, cuya actividad de otro modo ser reconocido por el inflamasoma NLRC4 e inducir la muerte celular rápida (pyroptosis) de la BMDMs ^15. Después de la infección las células se lavan y se tratan con 50 g / ml de digitonina durante 1 minuto. Las células se lavaron de nuevo inmediatamente y se incubaron con anticuerpos anti-Salmonella acoplados a FITC para marcar bacterias con acceso al citosol. Después de un lavado adicional células se lisan paso y el porcentaje de bacterias mCherry + (vacuolar) y FITC + / + mCherry (citosólica) se determina por FACS. Se presenta también una adaptación de este método que puede ser utilizado si no hay cepas que expresan proteínas fluorescentes están disponibles (Figura 2). Los pasos adicionales se introducen después del etiquetado FITC en el que las células se fijan y completamente permeabilizaron. A partir de entonces todas las bacterias se tiñen con anticuerpos anti-Salmonella y los correspondientes anticuerpos secundarios. Detexión se hace entonces por microscopía en lugar de análisis FACS.

Protocol

1. Ensayo Digitonina con mCherry expresan Salmonella (FACS basada en Análisis) Preparación de las bacterias Nota: Salmonella de tipo salvaje SL1344 (resistente a la estreptomicina) que expresa mCherry partir de un plásmido (que codifica pFPV mCherry bajo el promotor RPSM) se utiliza en este ensayo. La fagocitosis bacteriana y la proliferación donde no alterada por la expresión constitutiva de mCherry (datos no mostrados) 16. Inocular la cepa 1 día antes de la…

Representative Results

Figura 1 y Figura 2 muestran los esquemas del ensayo digitonin descritos en el protocolo 1 y el protocolo 2 ilustra los pasos críticos en el protocolo y los resultados obtenidos. La Figura 3 muestra los resultados típicos FACS. Los controles positivos y negativos se utilizan para ajustar las puertas para mCherry + / bacterias FITC (vacuolar Salmonella) y mCherry + / FITC + citosólico bacterias (Salmonella). Sobre la base de estas puertas el porcentaje de bacterias citos…

Discussion

Permeabilización diferencial es un método fácil y robusto para analizar y cuantificar la distribución subcelular de patógenos bacterianos entre compartimentos vacuolar y el citosol. El mismo ensayo ha sido utilizado con éxito con bacterias tales como Francisella novicida ^2,4 y Shigella flexneri ^12. Sin embargo, ya que muchos patógeno intracelular alterar o modificar las estructuras endomembrane anfitrionas, la robustez de la permeabilización digitonin tendrá que ser deter…

Materials

Digitonin	Sigma	D5628	50ug/mL
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Potassium Acetate	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponin	Sigma	47036
Vectashield mounting medium	Vectorlabs	H-1200
Anti Rabbit antibody-488	Molecular Probes	A-11070	1/500
Glycine	Sigma	G8898
Gentamicin	Life Technologies	15710-49	100ug/mL and 10ug/mL
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Confocal microscope	Zeiss		imaging done at 63x
FACS Fortessa	BD technologies		detection mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		detection FITC 530 nm