분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

Summary

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Abstract

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Introduction

혈관 내피 세포뿐만 아니라 혈액이나 조직을 분리하는 장벽 층, 그것은 400m2 ^(1)의 표면적 전체에 걸쳐 뻗어 혈관 트리 광대 내분비선 여겨진다. 내피의 복지는 혈관 항상성에 필수적이다. 역기능 내피는 동맥 경화증, 혈관염 및 허혈 / 재관류 손상 등 ^2-4 등 다양한 심혈관 질환에 참여하고 있습니다. 현재까지이 질환의 설정에 관련된 특정 세포 및 분자 메커니즘은 잘 의한 내피 세포의 확산 해부학 적 특성으로 이해되지 않습니다.

유전자 조작 기술은 다른 어떤 포유 동물 종에 비해 생쥐에서 개발되어 있기 때문에 마우스 연구의 중요한 모델이다. 대동맥의 작은 크기 enzymat하게 때문에 기본 쥐 대동맥 내피 세포의 분리는 특히 어려운 간주비현실적 내피 세포의 IC 소화. 일부는 분리 및 내장 컴퓨터가 ^{5-7을 필요로} 정화하는 과정을보고했다.

이 프로토콜의 목적은 특수한 장치를 사용하지 않고 마우스 대동맥 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 사용하는 것이다. 이 프로토콜에서 갓 격리 대동맥 작은 세그먼트로 절단 및 내피 세포 발아 수 있도록 아래로 향하게 내피 세포와 매트릭스에 시드. 세그먼트가 제거 된 후, 내피 세포는 내피 세포 선호 배지에서 확장되고 두 개 또는 세 개의 통로 후 실험에 대한 준비가되어 있습니다. 기술 된 방법의 이점은 그 1) 단일 대동맥 내피 세포 수확의 상당히 높은 수치; 2) 세포 생존 능력은 잘 보존된다 3) 특별한 장비 나 기술이 필요하지 않습니다. 이는 내피 세포의 병태 생리의 특정 세포와 분자 메카니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공한다. 홍보를 공부에 관심이있는 사람들을 위해어느 유전자 녹아웃 마우스에서 imary 배양 내피 세포, 유전자 녹아웃 생쥐 나 쥐 질병 모델이 프로토콜은 매우 유용하고 실천하기 쉽습니다.

Protocol

마우스에서 대동맥 1. 분리 여기에 설명 된 모든 절차가 웨인 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 마취 기계의 유도 챔버에 마우스를 넣습니다. 25 % 신선한 공기와 75 % O 2와 함께 4 %의 이소 플루 란 흐름을 설정합니다. 전용 코 콘 뒤에 유도 챔버를 통해 25 %의 신선한 공기와 75 % O 2와 함께 이소 플루 란 (유도 4 %가…

Representative Results

내피 세포 돋 자연 내피 세포는 마우스 대동맥 세그먼트에서 시작 발아. 마우스 대동맥 세그먼트는 4 일 동안 내피 세포 성장 배지에서 성장 인자 – 감소 된 매트릭스에서 성장시켰다. 4 일 – 내피 세포의 발아는 보통 2에 나타납니다. 현미경은 4 일 (그림 1)에 촬영했다. 사진에 나타낸 바와 같이, 다수의 내피 세포 떨어진 부분에서 이동한다. 새로 형성…

Discussion

이 연구는 특별한 장비없이 마우스 대동맥에서 세포를 분리 및 배양 내피하는 간단한 방법을 보여줍니다. 면역 염색 세포의 대부분이 제 2 통로 후 내피 세포이었던 것으로 나타났다. 제 3 통로에 두 번째의 세포는 시험 관내 및 내피 세포 생물학을 연구하는 생체 실험에 적합한 것이 좋습니다.

이 의정서에서 키 노트

절차에 오…

Materials

4- or 6-week-old mice (Jackson Laboratory, #000664).

Sterile 1X phosphate-buffered saline (PBS, Gibco, #10010-023).

Sterile 1X PBS containing 1,000 U/ml of heparin (Sigma Aldrich, H3149).

Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium[DMEM] with 25mM HEPES[Gibco, #12320-032 ], supplemented with 100μg/ml endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma,#2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/ml heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000U/ml penicillin and 10mg/ml streptomycin [Gibco, #15140-122]).

Growth factor reduced matrix (BD Biosciences, #356231).

Neutral proteinase (Dispase, 1U/ml, Fisher Scientific #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034g/L[Sigma, #1255], in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose[Gibco, #12320-032 ]).

Gelatin (100‑200 μg/cm2, Sigma, #G1393).

1,1`-dioctadecyl-3,3,3`,3`- tetramethylindo- carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL, Life Technologies, #L3484),  FITC-labeled Ulex europeus agglutinin (Ulex-Lectin, Sigma, #L9006),  Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody (BD Biosciences, # 553372).

Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody (Cell signaling, #9698), anti-mouse endothelial nitric oxide synthase (Abcam, #ab5589), anti-mouse vascular endothelium-cadherin (Abcam, #33168), anti-mouse calponin (Abcam, #700), FITC-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma, #F6005)

One ml syringe fitted with 25-G needle (Fisher Scientific, #50-900-04222).

100mm Peri dishes (Fisher Scientific,  #07-202-516).

Six-well cell culture plates (Fisher Scientific, #08-772-1B).

T12.5 cultuer flask (Fisher Scientific, #50-202-076)

Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade (Fine Science Tools, Inc)

Anesthesia machine with isoflurane (Webster Veterianary Supply, #07-806-3204), heating lamp

Centrifuge machine.

Inverted phase-contrast microscope.

inverted fluorescence microscope.