Udarbejdelse af Mica og Silicon Substrater for DNA Origami Analyse og eksperimenter

Summary

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Abstract

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Introduction

Først indført i 2006, DNA origami udnytter selvsamlende natur DNA-oligonukleotider til at producere designable og yderst ordnede nanostrukturer. ¹ Et utal af strukturer er blevet rapporteret, lige fra smiley ansigter til klinke 3-dimensionelle bokse. ² DNA origami kan funktionaliseres med forskellige biomolekyler og nanostrukturer, der giver anledning til forskningsansøgninger i nanoelektronik, medicin og kvantecomputere. ³ Men den analyse og mange fremtidige anvendelsesmuligheder er ikke kun afhængig af strukturelle design, men også af vedhæftning af DNA origami nanostrukturer til overflader. Beskrevet i dette manuskript metoder vedrører forberedelse af DNA origami prøver på to typer af underlag: glimmer og funktionaliserede siliciumoxid.

Glimmer er substratet af valg til DNA origami undersøgelser, fordi det er atomisk fladt, med et lag højde på 0,37 nm ± 0,02 nm. ⁴ Det er også easily renset, hvilket gør prøveforberedelse og atomic force mikroskopi (AFM) undersøgelser ligetil. Muskovit glimmer indeholder en høj densitet af kalium i hver spaltning plan, men disse ioner diffundere væk fra glimmeroverflade når i vand. At mediere binding af DNA origami til glimmer substratet, Mg2 ⁺ bruges til at vende den negative ladning af glimmer og binde elektrostatisk DNA phosphatrygraden til substratet (figur 1A). ⁵ Blandinger af udglødet DNA i nærvær af store overskud af korte tråde give høj dækning og gode billeder på glimmer fordi adhæsionen af DNA origami til Mg2 ⁺ -terminated overflade er meget stærkere end adhæsionen af enkeltstrengede oligonukleotider (korte strenge). Andre positivt ladede ioner, herunder Ni2 ⁺ og Co2 ⁺ kan anvendes til at styre vedhæftningen af DNA på glimmer. ^6,7 Ændring af koncentrationen af monovalente og divalente kationer i opløsningen kan mediere adhesion og overflade diffusionshastigheder DNA origami. ^8. Imidlertid protokollen for at forberede glimmer substrater og deponering og skylle origami ofte ikke eksplicit beskrevet i publicerede manuskripter. ⁹ Uden en klar protokol, kan reproducerbare resultater være vanskeligt at opnå.

Glimmer er en isolator, så det er ikke egnet som et substrat for visse applikationer i nanoelektronik. Silicium passiveret med en tynd indfødt oxid har ønskelige elektroniske egenskaber, herunder kompatibilitet med forudgående gratis metal-oxid halvleder (CMOS) behandling for at skabe input / output strukturer og topografiske funktioner. Siliciumskiver opbevaret i luft er passiveret med enten en tyk termisk oxid eller tynd nativt oxid film, der er relativt snavset, med en høj partikelformet tæller. Siliciumoxid har en meget lavere overflade ladningsdensitet end glimmer, og ladningstæthed er meget afhængig af forberedelse og historie oxid. Ved magnesium ionkoncentrationer Above 150 mM, gode dækningsområder (op til 4 / um ^2), i rektangulær DNA origami kan opnås på oxygen plasma behandlet siliciumsubstrater; dog kan denne koncentration og dækning ændre sig afhængigt af størrelse og design af nanostrukturer, der anvendes. ^10. En alternativ protokol til tuning overfladen afgift er at vedhæfte en kationisk selv-samlet monolag af 3-aminopropyltriethoxysilan (APTES) (figur 1B) til oxidet. Den primære amin på APTES kan protoneret ved pH-værdier under 9, modificere ladningen og hydrofobiciteten af substratet. ¹¹ For en komplet monolag af APTES med held deponeres, skal silicium passende renses med Radio Corporation of America (RCA) protokoller . Disse protokoller omfatter behandlinger i ammoniumhydroxid og hydrogenperoxidopløsninger (RCA1) for at fjerne organiske rester og partikel forureninger. En kort etch i vandig flussyre opløsning fjerner det native oxidlaget sammen medeventuelle ioniske urenheder, der overholder oxid. Endelig prøver udsat for en saltsyre og hydrogenperoxidopløsning (rca2) for at fjerne metal og ioniske kontaminanter og danne en tynd, ensartet oxidlag. ¹² De fleste renrum har udpeget hætter for CMOS rengøring protokoller, med strenge regler om, hvad der kan anvendes på disse områder. Et fælles problem kommer i form af ioner, såsom natrium, som kan forstyrre de elektroniske egenskaber af CMOS strukturer ved at skabe midbandgap fælder. ¹³ Ioner almindeligt anvendt i DNA origami forberedelse og deposition buffere kan forurene CMOS bade og forårsage problemer for andre forskere ved hjælp af den rene rum. Derfor vores gruppe anvender en "beskidt" CMOS rengøring bænk arrangeret specielt til de små prøver, der anvendes til DNA origami forskning. Denne proces er et godt alternativ til den traditionelle renrum opsætning og kan være egnet til laboratorier, der ikke har adgang til et renrum CMOS bænk.

Protocol

1. Eksperiment Planlægning og Klargøring Bestem design, koncentration og funktionalitet af DNA origami, der vil blive anvendt i eksperimenterne. 14-16 Her bruger vi en DNA origami rektangel design fremstillet i 1x TAE / Mg2 + opløsning (40 mM Tris-base, 20 mM eddikesyre, 2 mM EDTA og 12 mM magnesiumacetat, pH 8,0). 17 Autoklavér alle tips, rør og beholdere, der skal anvendes. Disse materialer skal alle være autoklave kompatible. Forbered en levering a…

Representative Results

To variabler diktere dækningen af ​​DNA origami på substratet: opløsningskoncentration og eksponeringstid. Adsorptions- karakteristika DNA origami på glimmer og APTES funktionaliseret siliciumoxid er tidligere blevet rapporteret. 13 Forholdet mellem koncentrationen af DNA origami i belægningsopløsning og de ​​endelige dækninger på glimmer er opsummeret i tabel 1 og figur 2, der viser stigende koncentration resulterer i øget dækning. Tidsafhængigheden af bin…

Discussion

Der er flere trin, der skal fremhæves for at opnå konsistente og ideelle resultater. For glimmer prøver, efter en streng og grundig skylning og tørring regime, som i trin 3.3 og 3.4, vil sikre, at billeder af individuelle DNA origami høj kvalitet kan opnås ved hjælp af AFM uden de forskellige problemer, der er skitseret i repræsentative resultater sektionen. Af primær betydning for silicium prøver er renligheden af ​​underlaget. Følge procedurerne rengøring skitseret i trin 5.2 grundigt og omhyggeligt vi…

Materials

Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μL	VWR International, LLC	22491733	10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR International, LLC	87003-290	0.65 mL, natural
Research Plus Pippete – Single Channel – 20-200 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960F-3120000054 EACH	Adjustable Volume
Research Plus Pippete – Single Channel – 2-20 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960D-3120000038 EACH	Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape	Office Depot, Inc.	602710	3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer	Thermo Scientific	M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm	Electron Microscopy Sciences	64917-2	6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat	Nova Electronic Materials, Ltd.	GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves	VWR International, LLC	82062-428	Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating	K-Tek Nanotechnology, Inc.	HA_NC/15
Autoclave Pan	A. Daigger & Company, Inc.	NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch – 1 dz	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	106-15055	Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square	Dynalon Corp.	316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality	Electron Microscopy Sciences	71850-01	10 per pack
Mica Disc, 10 mm	Ted Pella, Inc	50	Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware	VWR International, LLC	52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap – 20 mL	VWR International, LLC	66022-060	Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz	Dot Scientific, Inc.	6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth	VWR International, LLC	89043-554	Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 mL Capacity	VWR International, LLC	173506
Beakers, PTFE	VWR International, LLC	89026-022	For use with HF
Shallow form watch glass, 3"	VWR International, LLC	66112-107	Case of 12
Plastic Storage Container	VWR International, LLC	470195-354	For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers	VWR International, LLC	89095-564
High precision and ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences	78310-0
Polycarbonate Faceshield	Fisher Scientific, Inc.	18-999-4542
Neoprene Apron	Fisher Scientific, Inc.	19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate	W.W Grainger, Inc.	13W861	Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30 % CR ACS 500 mL	Fisher Scientific, Inc.	H325 500	HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane	Gelest Inc.	SIA0610.0-25GM	Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L	Fisher Scientific, Inc.	A669-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid	Fisher Scientific, Inc.	A144-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid	Fisher Scientific, Inc.	A147-1LB	HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa	Veeco Instruments, Inc.	n/a	Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket	Made in lab	Made in lab	The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.