We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
झिल्ली रिसेप्टर ligand बातचीत कई सेलुलर कार्यों मध्यस्थता। बंधन कैनेटीक्स और इन आणविक मुलाकातों से चालू होने वाले बहाव के संकेत दे संभावना यांत्रिक वातावरण में जो बाध्यकारी और संकेत जगह ले से प्रभावित हैं। एक ताजा अध्ययन में यांत्रिक बल द्वारा प्रतिजन मान्यता को विनियमित करने और टी सेल रिसेप्टर (TCR) के ट्रिगर कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया। इस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी को जोड़ती है जो एक नया हम विकसित प्रौद्योगिकी और करार दिया प्रतिदीप्ति biomembrane बल जांच (fBFP), के द्वारा ही संभव बनाया गया था। संवेदनशील बल सेंसर के रूप में एक उच्च गति कैमरा और वास्तविक समय इमेजिंग तकनीक पर नज़र रखने के लिए एक अति नरम मानव लाल रक्त कोशिका का प्रयोग, fBFP ~ 1 पी.एन. (10 -12 एन), ~ 3 एनएम की है और ~ 0.5 मिसे में बल, स्थानिक और लौकिक संकल्प। FBFP के साथ, एक ठीक बल विनियमन के तहत एक रिसेप्टर ligand के बंधन कैनेटीक्स और साथ ही छवि ट्रिगर बंधन इंट्रासेल्युलर कैलोरी उपाय कर सकते हैंcium एक भी जीवित कोशिका पर संकेत। इस नई तकनीक यांत्रिक विनियमन के तहत अन्य कोशिकाओं में अन्य झिल्ली रिसेप्टर ligand के संपर्क और संकेतन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
सेल के लिए सेल और सेल के लिए बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आसंजन कोशिका की सतह रिसेप्टर्स, ईसीएम प्रोटीन, और / या लिपिड 1 के बीच बंधन से मध्यस्थता है। बंधन कोशिकाओं कार्यात्मक संरचनाओं 1 फार्म, साथ ही पहचान है, संवाद, और पर्यावरण 1-3 करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देता है। घुलनशील प्रोटीन (जैसे, साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों) एक तीन आयामी (3 डी) से है कि बाँध कोशिका की सतह रिसेप्टर्स पर तरल पदार्थ चरण के विपरीत, कोशिका आसंजन रिसेप्टर्स आणविक विवश है कि दो विरोधी सतहों को पाटने के लिए एक संकीर्ण junctional अंतराल में उनके ligands के साथ बांड फार्म एक दो आयामी (2 डी) इंटरफेस 4-7 में प्रसार। आमतौर पर पारंपरिक बंधन assays के (जैसे, सतह plasmon अनुनाद या एसपीआर) द्वारा मापा जाता है कि 3 डी कैनेटीक्स के विपरीत, कक्ष 11,12 प्रवाह, इस तरह के परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 8-10 के रूप में विशेष तकनीक के साथ मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए 2 डी कैनेटीक्स है micropipette 13,14, ऑप्टिकलचिमटी 15 और biomembrane बल जांच (BFP) 16-21।
केवल सेलुलर सामंजस्य के लिए शारीरिक संबंध उपलब्ध कराने से भी ज्यादा, आसंजन अणुओं अपने परिवेश के साथ बातचीत करने के लिए सेल के लिए संकेत मशीनरी के एक प्रमुख घटक हैं। आसंजन अणुओं की लिगेंड सगाई इंट्रासेल्युलर संकेतन और कैसे प्रारंभिक संकेत सेल के अंदर transduced है शुरू की कैसे समझ में बढ़ती रुचि रही है। Intuitively, रिसेप्टर ligand के गुण यह लाती संकेतों को प्रभावित कर सकता बाध्यकारी। हालांकि, यह क्योंकि जैसे उनके कई सीमाएं हैं, एक गरीब अस्थायी समाधान और स्थानिक संकल्प के पूर्ण अभाव की जैव रासायनिक assays के पारंपरिक पहनावा का उपयोग कर कोशिकी बातचीत और intracellular संकेतन घटनाओं के बीच यंत्रवत रिश्तों को काटना मुश्किल है। Live पर दोनों जैवभौतिक (कैनेटीक्स बाध्यकारी 2D रिसेप्टर ligand) की अनुमति देने के तरीकों कि और जैव रासायनिक (संकेत) टिप्पणियों मौजूदाकोशिकाओं प्रतिदीप्ति क्षमता 24-26 के साथ शामिल ट्यून करने योग्य कठोरता 22 के substrates के, 23 इलास्टोमेर स्तंभ सरणियों और प्रवाह कक्ष / microfluidic उपकरणों में शामिल हैं। हालांकि, सिगनल और बाध्यकारी रिसेप्टर ligand के readouts यह मुश्किल संकेत घटनाओं के साथ बंधन विशेषताओं के अस्थायी और स्थानिक संबंधों काटना, जिससे (विभिन्न तरीकों से सबसे अधिक बार) अलग से प्राप्त किया जाना है।
परम्परागत BFP उच्च spatiotemporal संकल्प 17 के साथ एक ultrasensitive बल स्पेक्ट्रोस्कोपी है। यह एकल अणु 2 डी कैनेटीक्स, यांत्रिक गुणों और गठनात्मक परिवर्तन 14,16,19-21,27-29 की माप को सक्षम करने, एक बल सेंसर के रूप में एक लचीला लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) का उपयोग करता है। एक फ्लोरोसेंट इमेजिंग आधारित BFP (fBFP) एकल अणु पैमाने पर बाध्यकारी ट्रिगर कोशिका संकेतन के साथ रिसेप्टर ligand के बंधन कैनेटीक्स संबद्ध करता है। सतह mechani के संदर्भ में सीटू कोशिका संकेतन गतिविधियों में इस सेटअप के साथसीएएल उत्तेजना टी कोशिकाओं 27 में मनाया गया। fBFP बहुमुखी है और अन्य कोशिकाओं में अन्य अणुओं द्वारा मध्यस्थता सेल आसंजन और संकेतन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एक सफल fBFP प्रयोग कुछ महत्वपूर्ण बातों को जरूरत पर जोर देता। बल गणना विश्वसनीय होने के लिए सबसे पहले, micropipette, आरबीसी, और जांच मनका संभव के रूप में समाक्षीय करने के लिए करीब के रूप में गठबंधन किया जाना चाहिए। …
The authors have nothing to disclose.
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Table 1: Reagents/Equipment | |||
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
3-MERCAPTOPROPYLTRIMETHOXYSILANE(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
1ml Syringe | BD | 309602 | Chamber assembly |
Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
Camera, GE680, 640×480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
Prosilica GC1290 – ICX445, 1/3", C-Mount, 1280×960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
Table 2: Buffer solutions | |||
Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | |||
Sodium Carbonate (Na2CO3) | 8.4g/L | ||
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | 10.6g/L | ||
Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | |||
NaPhosphate monobasic NaH2PO4•H2O | 27.6g/L | ||
Anhy. NaPhosphate dibasic Na2HPO4 | 28.4g/L | ||
N2-5% buffer (pH 7.2) | |||
Potassium chloride (KCl) | 20.77g/L | ||
Sodium chloride (NaCl) | 2.38g/L | ||
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | 0.13g/L | ||
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | 0.71g/L | ||
Sucrose | 9.70g/L |