مضان غشاء حيوي قوة دقق: الكميات المتزامنة من حركية مستقبلات يجند والتي يسببها ملزم بين الخلايا اشارة على خلية واحدة
Summary
We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
Abstract
الغشاء مستقبلات يجند التفاعل تتوسط العديد من الوظائف الخلوية. ملزمة حركية وإشارات المصب الناجمة عن هذه التفاعلات الجزيئية المرجح تتأثر البيئة الميكانيكية التي ملزما ويشير تجري. أظهرت دراسة حديثة أن قوة ميكانيكية يمكن أن تنظم الاعتراف المستضد من قبل، ويتسبب في مستقبلات الخلايا التائية (TCR). وقد أصبح هذا ممكنا بفضل التكنولوجيا الجديدة التي قمنا بتطويرها ومضان يطلق قوة غشاء حيوي التحقيق (fBFP)، الذي يجمع بين جزيء واحد قوة التحليل الطيفي مع مضان المجهري. باستخدام خلايا الدم الحمراء في الانسان فائقة النعومة كما استشعار القوة حساسة، وكاميرا عالية السرعة والوقت الحقيقي تتبع تقنيات التصوير، وfBFP هو من ~ 1 السندات الإذنية (10 -12 N)، ~ 3 ~ نانومتر و 0.5 مللي ثانية في القوة، القرار المكانية والزمانية. مع fBFP، يمكن للمرء أن قياس بدقة حركية مستقبلات يجند واحدة ملزمة بموجب المادة القوة في وقت واحد صورة أثار ملزم كال داخل الخلاياcium يشير على خلية حية واحدة. هذه التكنولوجيا الجديدة يمكن استخدامها لدراسة أخرى الغشاء مستقبلات يجند التفاعل ويشير في الخلايا الأخرى في إطار التنظيم الميكانيكي.
Introduction
خلية الى خلية والخلية الى خارج الخلية مصفوفة بوساطة (ECM) التصاق عن طريق الربط بين مستقبلات سطح الخلية والبروتينات ECM، و / أو الدهون 1. ملزمة تمكن خلايا لتشكيل هياكل وظيفية 1، وكذلك الاعتراف، والتواصل، والتفاعل مع البيئة 1-3. على عكس البروتينات القابلة للذوبان (مثل السيتوكينات وعوامل النمو) التي تربط من ثلاثي الأبعاد (3D) المائع على مستقبلات سطح الخلية، مستقبلات التصاق الخلايا تشكل السندات مع بروابط بهم عبر فجوة ضيقة صلي لسد سطحين معارضة التي تقيد الجزيئية نشر في الأبعاد (2D) واجهة اثنين 4-7. وعلى النقيض من حركية 3D والتي يتم قياسها عادة من قبل المقايسات ملزمة التقليدية (على سبيل المثال، صدى مأكل السطح أو SPR)، حركية 2D يجب أن يكون كميا مع تقنيات متخصصة مثل قوة المجهر الذري (AFM) 10/08، غرفة 11،12 التدفق، micropipette 13،14، البصريملاقط 15 وقوة غشاء حيوي التحقيق (حزب الحرية) 16-21.
أكثر من مجرد توفير الربط المادي للتماسك الخلوي، جزيئات الالتصاق هي العنصر الرئيسي في آلية إشارات للخلية للتواصل مع محيطه. لم يكن هناك اهتمام متزايد في فهم كيفية إشراك يجند من جزيئات الالتصاق يبدأ الإشارات بين الخلايا وكيفية transduced إشارة أولية داخل الخلية. حدسي، خصائص مستقبلات يجند ملزمة يمكن أن تؤثر على الإشارات التي يدفع. ومع ذلك، فإنه من الصعب تشريح العلاقات الميكانيكية بين التفاعل خارج الخلية والأحداث الإشارات بين الخلايا باستخدام الفرقة التقليدية للفحوصات البيوكيميائية بسبب العديد من القيود المفروضة عليها، على سبيل المثال، وهو القرار الزماني الفقراء والانعدام التام للقرار المكاني. الطرق التي تسمح لكل من الفيزياء الحيوية (2D حركية ملزمة مستقبلات يجند) والكيمياء الحيوية (إشارات) ملاحظات على الهواء مباشرة الحاليةوتشمل خلايا ركائز من صلابة الانضباطي 22، المطاط الصناعي صفائف العمود 23 والأجهزة تدفق غرفة / ميكروفلويديك تدمج مع القدرة مضان 24-26. ومع ذلك، قراءات من الإشارات وملزمة مستقبلات يجند لها التي يمكن الحصول عليها بشكل منفصل (في معظم الأحيان عن طريق وسائل مختلفة)، مما يجعل من الصعب تشريح العلاقات الزمانية والمكانية للخصائص السندات مع إشارات الأحداث.
BFP التقليدي هو التحليل الطيفي قوة فائق الحساسية لقرار الزمانية المكانية عالية (17). ويستخدم خلية مرنة الدم الحمراء (RBC) كجهاز استشعار القوة، مما يتيح قياس حركية 2D جزيء واحد، الخواص الميكانيكية والتغيرات متعلق بتكوين 14،16،19-21،27-29. A BFP التصوير الفلورسنت مقرها (fBFP) يرتبط حركية مستقبلات يجند الملزمة مع الخلايا مما يشير الى اثار ملزم على نطاق واسع جزيء واحد. مع هذا الإعداد، في أنشطة الخلايا مما يشير الى الوضع الطبيعي في سياق mechani السطحولوحظ التحفيز كال في الخلايا T-27. وfBFP هي متعددة ويمكن استخدامها لدراسات التصاق الخلايا والإشارات بوساطة جزيئات أخرى في خلايا أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
تجربة ناجحة fBFP ينطوي على بعض الاعتبارات الهامة. أولا، لحساب القوة لتكون موثوقة، وmicropipette، وRBC، وحبة التحقيق يجب أن تكون محاذاة أقرب إلى محوري وقت ممكن. يجب أن يكون الإسقاط من RBC داخل ماصة حوالي واحد قطره التحقيق ماصة بحيث الاحتكاك بين RBC وماصة لا يكاد يذكر. لRBC البشري نم?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Materials
| Table 1: Reagents/Equipment | |||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-MERCAPTOPROPYLTRIMETHOXYSILANE(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1ml Syringe | BD | 309602 | Chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640×480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 – ICX445, 1/3", C-Mount, 1280×960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Table 2: Buffer solutions | |||
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | |||
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | 8.4g/L | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | 10.6g/L | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | |||
| NaPhosphate monobasic NaH2PO4•H2O | 27.6g/L | ||
| Anhy. NaPhosphate dibasic Na2HPO4 | 28.4g/L | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | |||
| Potassium chloride (KCl) | 20.77g/L | ||
| Sodium chloride (NaCl) | 2.38g/L | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | 0.13g/L | ||
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | 0.71g/L | ||
| Sucrose | 9.70g/L | ||
References
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
