Fluorescens Biomembrane Force Probe: Samtidig Kvantifisering av Receptor-ligand Kinetics og Binding-indusert intracellulære signal på en enkelt celle
Summary
We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
Abstract
Membran reseptor-ligand interaksjoner medierer mange cellefunksjoner. Bindende kinetikk og nedstrøms signal utløst av disse molekylære interaksjonene er trolig påvirket av den mekaniske miljø der bindingen og signalering finner sted. En ny studie viste at mekanisk kraft kan regulere antigen gjenkjennelse av og aktivering av T-cellereseptoren (TCR). Dette ble gjort mulig av en ny teknologi vi utviklet og betegnet fluorescens biomembrane kraft probe (FBFP), som kombinerer single-molekyl kraft spektroskopi med fluorescens mikroskopi. Ved hjelp av en ultra-myk menneskelige røde blodceller som sensitive kraft-sensor, et high-speed kamera og sanntids bildebehandling sporing teknikker, er FBFP av ~ 1 PN (10 -12 N), ~ 3 nm og ~ 0,5 msek i kraft, romlig og tidsmessig oppløsning. Med FBFP kan man presist måle enkelt reseptor-ligand bindingskinetikk under tvang regulering og samtidig image binding-utløst intracellulær calCium signalering på en enkelt levende celle. Denne nye teknologi kan benyttes for å studere andre membran reseptor-ligand-interaksjon og signalisering i andre celler under mekanisk regulering.
Introduction
Celle-til-celle og celle-til-ekstracellulær matriks (ECM) adhesjon mediert av binding mellom celleoverflatereseptorer, ECM-proteiner, lipider og / eller en. Binding tillater cellene å danne funksjonelle strukturer 1, så vel som gjenkjenne, kommunisere og reagerer på miljøet 1-3. Til forskjell fra løselige proteiner (f.eks, cytokiner og vekstfaktorer) som binder seg fra en tre-dimensjonal (3D) væskefasen til celleoverflatereseptorene, celle adhesjonsreseptorer danne bindinger med deres ligander over en smal junctional gap for å bygge bro to motstående flater som begrenser molekyl diffusjon i en dimensjonal (2D) grensesnitt 4-7 to. I motsetning til 3D-kinetikk som vanligvis måles ved tradisjonelle bindingsanalyser (for eksempel overflate-plasmonresonans eller SPR), 2D kinetikken er å kvantifisere med spesialiserte teknikker som atomkraftmikroskopi (AFM) 8-10, strømningskamret 11,12, mikropipette 13,14, optiskpinsett 15 og biomembrane kraft probe (BFP) 16-21.
Mer enn bare å gi fysisk binding for cellulær kohesjon, adhesjonsmolekyler er en viktig del av signal maskiner for cellen til å kommunisere med omgivelsene. Det har vært en økende interesse for å forstå hvordan ligand inngrep av adhesjonsmolekyler initierer intracellulær signalisering, og hvor det opprinnelige signal blir omformet inne i cellen. Intuitivt egenskapene til reseptor-ligand binding kan påvirke signalene det fremkaller. Det er imidlertid vanskelig å dissekere mekanistiske forhold mellom det ekstracellulære interaksjon og intracellulære signalhendelser ved hjelp av tradisjonelle ensemble av biokjemiske analyser på grunn av deres mange begrensninger, f.eks, en dårlig tidsmessig oppløsning og den fullstendige mangel på romlig oppløsning. Eksisterende metoder som tillater både biofysiske (2D reseptor-ligand binding kinetikk) og biokjemiske (signalanlegg) observasjoner på levendeceller inkluderer substrater av tunbare stivhet 22, elastomer søyle arrays 23 og strømningskamret / microfluidic enheter innlemmet med fluorescens evne 24-26. Men avlesninger av signalering og reseptor-ligand binding må skaffes separat (oftest ved ulike metoder), noe som gjør det vanskelig å dissekere tidsmessige og romlige relasjoner for obligasjons egenskaper med signale hendelser.
Konvensjonell BFP er en ultra kraft spektroskopi med høy tid og rom oppløsning 17. Den bruker en fleksibel røde blodceller (RBC) som en kraftmåler, slik at måling av enkelt-molekyl 2D kinetikk, mekaniske egenskaper og konformasjonsendringer 14,16,19-21,27-29. En fluoriserende bildebasert BFP (FBFP) korrelerer reseptor-ligand-bindingskinetikken med bindingen-utløste cellesignalisering ved enkelt-molekyl skala. Med dette oppsettet, in situ cellesignale aktiviteter i sammenheng med overflate mekanismercal stimulering ble observert i T-celler 27. Den FBFP er allsidig og kan anvendes for undersøkelser av celle-adhesjon og signalisering medieres av andre molekyler i andre celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
En vellykket FBFP forsøket innebærer noen kritiske betraktninger. Først, for den kraft som beregningen for å være pålitelig, mikropipette, RBC, og sonden vulsten må være tilpasset så nær koaksial som mulig. Projeksjonen av RBC inne i pipetten bør være omtrent en sonde pipette diameter, slik at friksjonen mellom RBC og pipetten er ubetydelig. For en typisk human RBC, er den optimale pipetten diameter 2,0 til 2,4 pm, noe som gir en beste tilpasning av ligning 1 17,30. For det andre, for å sikre må…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Materials
| Table 1: Reagents/Equipment | |||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-MERCAPTOPROPYLTRIMETHOXYSILANE(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1ml Syringe | BD | 309602 | Chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640×480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 – ICX445, 1/3", C-Mount, 1280×960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Table 2: Buffer solutions | |||
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | |||
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | 8.4g/L | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | 10.6g/L | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | |||
| NaPhosphate monobasic NaH2PO4•H2O | 27.6g/L | ||
| Anhy. NaPhosphate dibasic Na2HPO4 | 28.4g/L | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | |||
| Potassium chloride (KCl) | 20.77g/L | ||
| Sodium chloride (NaCl) | 2.38g/L | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | 0.13g/L | ||
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | 0.71g/L | ||
| Sucrose | 9.70g/L | ||
References
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
