We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
Interacções ligando-receptor de membrana medeiam muitas funções celulares. Encadernação cinética e sinalização a jusante desencadeada por essas interações moleculares são provavelmente afectado pelo ambiente em que a ligação mecânica e sinalização ocorrem. Um estudo recente demonstrou que a força mecânica pode regular o reconhecimento do antigénio pelo desencadeamento e do receptor de células T (TCR). Isso foi possível graças a uma nova tecnologia que nós desenvolvemos e fluorescência denominadas sonda vigor biomembrana (fBFP), que combina força espectroscopia única molécula com microscopia de fluorescência. Usando um glóbulo vermelho humano ultra-suave como o sensor de força sensível, uma câmera de alta velocidade e em tempo real técnicas de rastreamento de imagens, o fBFP é de ~ 1 pN (10 -12 N), a 3 nm e ~ 0,5 ms em vigor, a resolução espacial e temporal. Com o fBFP, pode-se medir com precisão cinética de ligação ligando-receptor individuais no âmbito da regulamentação vigente e cal intracelular simultaneamente imagem ligação desencadeadaCium sinalização sobre uma única célula viva. Esta nova tecnologia pode ser utilizada para estudar a interacção receptor-ligando outra membrana e sinalização em outras células sob regulação mecânica.
Célula-a-célula e célula-matriz extracelular de (ECM) adesão é mediada pela ligação entre os receptores da superfície celular, proteínas de ECM, e / ou lípidos 1. A ligação permite que as células de modo a formar uma estrutura funcional, bem como reconhecer, comunicar, e reagir ao ambiente 1-3. Ao contrário de proteínas solúveis (por exemplo, citoquinas e factores de crescimento) que se ligam de uma imagem tridimensional (3D) de fase fluida para os receptores da superfície celular, os receptores de adesão de células formar ligações com os seus ligandos através de uma das junções de hiato estreita para unir duas superfícies opostas que limitam molecular difusão numa dimensional (2D) de interface dois 4-7. Em contraste com a cinética de 3D que são vulgarmente medidos por ensaios de ligação tradicionais (por exemplo, de ressonância de plasmon de superfície ou SPR), a cinética 2D têm de ser quantificado com técnicas especializadas, tais como microscopia de força atómica (AFM), 8-10, câmara de fluxo 11,12, micropipeta 13,14, ópticopinças 15 e sonda vigor biomembrana (BFP) 16-21.
Mais do que simplesmente fornecendo ligação física para a coesão celular, moléculas de adesão são um dos principais componentes da maquinaria de sinalização para a célula comunique com o espaço envolvente. Tem havido um interesse crescente na compreensão de como ligando acoplamento de moléculas de adesão inicia a sinalização intracelular e como o sinal inicial é transduzida no interior da célula. Intuitivamente, propriedades de receptor-ligando de ligação pode ter um impacto que induz os sinais. No entanto, é difícil para dissecar as relações mecanicistas entre a interação extracelular e eventos de sinalização intracelular utilizando conjunto tradicional de ensaios bioquímicos por causa de suas muitas limitações, por exemplo, uma resolução temporal pobres e completa falta de resolução espacial. Métodos que permitem tanto biofísico (cinética de ligação ao receptor do ligando 2D) e (sinalização) observações bioquímicas em directo existentecélulas incluem substratos de rigidez ajustável 22, elastômero pilar matrizes 23 e dispositivos de câmara de fluxo / microfluídicos incorporados com capacidade de fluorescência 24-26. No entanto, as leituras de sinalização e de ligação ao receptor do ligando tem que ser obtido separadamente (na maioria das vezes através de métodos diferentes), o que torna difícil para dissecar as relações temporais e espaciais das características de títulos com eventos de sinalização.
BFP convencional é uma espectroscopia de força ultra-sensível de alta resolução espaço-temporal 17. Ele usa uma célula de sangue vermelho flexível (RBC) na forma de um sensor de força, permitindo a medição da cinética de 2D única molécula, propriedades mecânicas e alterações conformacionais 14,16,19-21,27-29. A BFP baseado imagens fluorescentes (fBFP) correlaciona-se a cinética de ligação ligando-receptor com a sinalização celular desencadeada obrigatório-a escala única molécula. Com esta configuração, em atividades de sinalização celular situ no contexto de mechani superfíciecal estimulação foi observada em células T-27. O fBFP é versátil e pode ser utilizado para estudos de adesão celular e de sinalização mediadas por outras moléculas em outras células.
A experiência bem sucedida fBFP implica algumas considerações críticas. Em primeiro lugar, para o cálculo de força para ser confiável, micropipeta, a RBC, eo talão sonda deve ser alinhado como perto de coaxial possível. A projecção do RBC dentro da pipeta deve ser de cerca de um diâmetro de sonda de pipeta de modo que o atrito entre a RBC e a pipeta é negligenciável. Para um RBC humano típico, o diâmetro ideal pipeta é 2,0-2,4 mm, que produz um melhor ajuste da Equação 1 17,30. Em segundo l…
The authors have nothing to disclose.
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Table 1: Reagents/Equipment | |||
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
3-MERCAPTOPROPYLTRIMETHOXYSILANE(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
1ml Syringe | BD | 309602 | Chamber assembly |
Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
Camera, GE680, 640×480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
Prosilica GC1290 – ICX445, 1/3", C-Mount, 1280×960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
Table 2: Buffer solutions | |||
Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | |||
Sodium Carbonate (Na2CO3) | 8.4g/L | ||
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | 10.6g/L | ||
Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | |||
NaPhosphate monobasic NaH2PO4•H2O | 27.6g/L | ||
Anhy. NaPhosphate dibasic Na2HPO4 | 28.4g/L | ||
N2-5% buffer (pH 7.2) | |||
Potassium chloride (KCl) | 20.77g/L | ||
Sodium chloride (NaCl) | 2.38g/L | ||
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | 0.13g/L | ||
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | 0.71g/L | ||
Sucrose | 9.70g/L |